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三肽囊素(Bursin,BS)是存在于禽类法氏囊中的活性小分子肽,其结构为赖氨酸-组氨酸-甘氨酸(Lys-His-Gly-NH2)。国内外研究结果表明,BS具有增强免疫和促进畜禽生长的功能。本研究根据大肠杆菌编码外源蛋白的特异性,设计合成串联4肽BS,并连接融合肽编码序列,构建重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌进行原核表达,并探索和优化可溶性表达条件。设计动物实验研究BS可溶性蛋白和包涵体生长免疫调节功能并检测其安全性,为后期批量生产BS和进一步深入研究奠定基础。1 BS可溶性表达及表达条件的优化:设计合成BS融合肽编码序列并将其连接表达载体pET-32a质粒,构建重组质粒pET-BS,经测序正确后,将pET-BS转化到BL21,诱导其表达可溶性BS蛋白;摸索优化温度、诱导剂、诱导前菌液浓度、诱导表达时间、IPTG浓度和蔗糖浓度等表达条件,并纯化可溶性BS。结果表明:BS可溶性表达时的最佳温度为24.5℃;添加蔗糖和IPTG作为诱导剂时,效果优于单独添加IPTG或蔗糖;诱导前的最佳菌液浓度在OD600=0.44-0.60之间;最佳的诱导表达的时间为10h;诱导表达时最佳IPTG终浓度为24 μg/mL;蔗糖诱导时的最佳浓度为1.0 g/100mL;通过对纯化条件摸索发现,可溶性BS蛋白中His标签蛋白与ProteinlsoTM Ni-NTA Resin中的Ni+结合良好,用200 mM咪唑可溶性平衡液可完全洗涤目的BS,纯化效果良好。2 BS对小鼠生长免疫性能的影响:以完全空白组和正常免疫组(正常免疫禽流感病毒(AIV)灭活苗)作为对照组,分别将BS可溶性蛋白以不同剂量经肌注方式接种KM小鼠,设为BS肌注高剂量组、BS肌注中剂量和BS肌注低剂量组,分别以不同浓度包涵体蛋白经灌胃方式接种小鼠,设为BS 口服高剂量组、BS 口服中剂量组和BS 口服低剂量组,在BS接种小鼠时均联合免疫AIV灭活苗,一免后2周(W)进行二免;在一免当天(0W)和一免后1W、2 W、3 W、4 W和5 W对全部小鼠进行称重;在一免后2 W、3 W、4 W和5 W各组随机取10只小鼠(雌雄对半)摘眼球采集全血,分离血清检测其抗AIV特异性抗体;称量后计算其胸腺和脾脏的免疫器官指数;取部分一免后2 W和5 W小鼠的肝脏和肾脏组织进行HE染色观察其病理变化;检测实验小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、球蛋白、白蛋白、尿素氮和肌酐等肝脏功能和肾脏功能指标。结果表明:中剂量肌注BS对小鼠生长有促进作用(P<0.05);口服BS包涵体对小鼠生长促进作用不显著(P>0.05)。BS对脾脏免疫器官指数作用不显著(P>0.05),对胸腺有一定促进其发育的作用(P<0.05);HI结果表明:肌注BS在前期对小鼠抗AIV抗体产生效果不显著(P>0.05),但在后期有维持抗体水平作用(P<0.05);而BS 口服则在前期有促进小鼠抗体产生的作用,但效果差异不显著(P>0.05);HE实验和血清中肝功能和肾功能因子检测表明:BS对小鼠安全,动物肝脏和肾脏无可见病理变化,功能因子水平未见异常。结论:BS对小鼠具有促进生长作用,对抗体的产生具有促进作用和维持作用,对小鼠无毒副作用,安全性能较好。