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人工授精(Artificial insemination,AI)技术是提高家畜繁殖效率的重要环节,因此筛选获得高质量的冻精非常重要。然而,冻融过程导致精子品质降低,繁殖力下降,影响了良种公牛种用价值,而且增加养殖成本。以往研究表明,细胞及生物体可通过合成热应激蛋白HSPs来保护细胞免受外界伤害,且HSPs的表达水平与公畜的受精率密切相关。目前,尚无关于牦牛HSP70和HSP90与精子品质相关性的报道。本研究以牦牛鲜精和冻融精子为试验材料,经45%Percoll单层梯度液纯化后,通过检测和分析牦牛精子质量和精子内酶活性差异,采用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术检测HSP70和HSP90表达情况,并分析牦牛HSP70和HSP90表达量与精子质量的相关性,为牦牛精子质量和繁殖力的高低进行标记辅助评价提供科学依据。主要研究结果如下:1.试剂盒(RNeasy Kit)、热TRIzol和TRIzol一步法都可以获得牦牛精子总RNA,但试剂盒提取的精子总RNA质量(浓度、纯度、完整性)优于另外两种方法(P<0.05)。2.通过比较鲜精和冻精的精子活力、畸形率、顶体完整率和质膜完整率发现,与鲜精相比,冻融后精子活力降低50.54%(P<0.01),精子畸形率提高56.60%(P<0.01),精子顶体完整率降低32.33%(P<0.01),精子质膜完整率降低51.28%(P<0.01)。扫描电镜结果显示,鲜精的质膜和顶体光滑且完整,而部分冻融精子质膜和顶体受损。酶活性检测结果发现,冻融后精子内GSH-PX、SOD、AST、ACP和LDH酶活极显著低于鲜精(P<0.01),与鲜精相比,分别降低67.65%、67.38%、61.58%、49.53%和47.06%。3.牦牛鲜精与冻精HSP70和HSP90表达差异比较研究中发现,冻融精子HSP70和HSP90在转录和蛋白水平表达量均显著低于鲜精(P<0.05)。鲜精HSP70蛋白主要在精子顶体区、顶体赤道段、后顶体区、精子中段以及精子尾部表达,而冻精HSP70蛋白主要在精子后顶体区和精子中段表达且平均光密度值极显著降低(P<0.01)。鲜精和冻精中HSP90蛋白表达均在精子中段和尾部表达,冻融精子中段HSP90的荧光信号强度极显著低于鲜精(P<0.01),暗示蛋白定位与精子品质有关。相关性分析可知,HSP70表达量与精子活力(r=0.753,P<0.01)、质膜完整率(r=0.656,P<0.05)以及顶体完整率(r=0.632,P<0.05)之间均存在显著正相关。精子HSP90表达量与精子活力(r=0.723,P<0.01)、质膜完整率(r=0.586,P<0.05)之间存在显著正相关,而HSP90表达量与顶体完整率(r=0.370,P>0.05)之间存在正相关。综上表明,冻融导致精子品质、HSP70、HSP90表达量显著降低,且HSP70、HSP90 mRNA表达量与精子品质存在正相关,可作为评价牦牛精子品质的指标。