研究目的：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是严重危害人类健康的心脑血管疾病的主要病理基础,其发病机制复杂且尚不完全清楚。越来越多的研究认为AS是一种血管受损后发生的免疫炎症过程。连接粘附分子样蛋白(Junction adhesion molecule-like protein, JAML, Amical)是新近发现的连接粘附分子(Junctional adhesion molecules, JAMs)家族成员,属于分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。现有研究表明,JAML主要分布于中性粒细胞、单核/巨噬细胞和多种T细胞等免疫细胞中,通过调节单核细胞的粘附和跨内皮迁移、γδT细胞释放炎症因子和生长因子,在免疫调控、炎症反应和损伤修复中发挥着重要作用。但是,JAML是否参与了AS这种炎症性疾病的发生和发展的病理过程,是否对AS斑块中的炎症反应和巨噬细胞功能具有调控作用,至今尚未见报道。因此,本课题从体内和体外两个方面探讨JAML在AS发生和发展以及对巨噬细胞功能的调节作用,从而为防治AS提供新的药物治疗靶点。研究方法：1.体内实验检测JAML在AS斑块中的表达及变化实验采用冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的有明显狭窄和有少量斑块的冠状动脉,用免疫组织化学法观察JAML的分布情况和表达变化；免疫荧光双标法和激光共聚焦技术检测JAML在斑块内的表达和具体细胞定位。采用ApoE基因敲除(Apolipoprotein E gene knockout, ApoE-/-)合并高脂饮食制备的AS模型小鼠及其遗传背景C57BL/6小鼠作为实验对照,利用蛋白免疫印迹法检测JAML在AS斑块组织内表达水平的变化。2.体内实验探讨JAML在AS发生和发展过程中的作用及对斑块内炎症反应和NF-κB信号通路的调节实验利用ApoE-/-小鼠分别制备早期AS斑块模型和晚期AS易损斑块模型,两种实验动物模型均采用慢病毒转染的方法分别转染目的基因JAML shRNA或转染对照shRNA。每组动物采用酶法检测血清中总胆固醇(Total cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)和高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)水平；利用大体油红O染色测定主动脉的斑块面积；冰冻切片进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)染色、油红O染色、免疫组织化学染色、天狼猩红染色分别检测斑块面积、脂质含量、巨噬细胞浸润、平滑肌细胞以及胶原含量,并最终计算斑块的易损指数；免疫组织化学方法检测斑块组织中炎症因子白介素(Interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子α (Turner necrosis factor-α, TNFα)的表达水平；蛋白免疫印迹技术检测磷酸化p65表达水平观察核因子KB(Neuclear factor-kappa B, NF-κB)信号通路的活化情况。3.体外实验验证JAML在oxLDL活化的单核/巨噬细胞中的作用及对NF-κB信号通路的调控选取可以代表斑块内主要细胞成分的原代脐静脉内皮细胞、人外周血单核细胞、小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7和平滑肌细胞株,采用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术检测了JAML基因的表达水平；小鼠单核/巨噬细胞株RAW 264.7给予不同浓度或不同时间点的氧化型低密度脂蛋白(Oxidized-low density lipoprotein,oxLDL)、脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、 TNFα不同刺激物刺激,蛋白免疫印迹法检测JAML的表达变化；采用小干扰RNA脂质体瞬时转染技术沉默巨噬细胞中JAML的表达,实时定量RT-PCR方法检测oxLDL刺激的巨噬细胞中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)、IL-10 mRNA水平的变化,并且用蛋白免疫印迹的方法检测磷酸化p65的表达观察NF-κB信号通路的活化情况。结果：1.体内实验表明,与有少量斑块的冠状动脉相比,具有明显狭窄的AS患者的斑块组织内JAML的表达量明显升高；免疫荧光双标结果显示JAML在斑块内的巨噬细胞中表达较为丰富,在斑块内其他两种主要细胞成分—内皮细胞和平滑肌细胞中也有少量表达。同样的结果也在小鼠AS模型中得到了进一步的证实,与正常C57BL/6小鼠相比,ApoE-/-AS模型小鼠主动脉中JAML的表达明显上调。2.动物实验进一步证实,早期和晚期两种AS斑块模型均表现为JAML基因沉默与对照组相比,体重无统计学差异,同时血清学检测显示小鼠TC、TG、LDL和HDL水平也无显著性差异；主动脉大体油红O染色显示JAML基因沉默可以明显减少早期AS斑块的形成；各种病理学和免疫组织化学染色显示干扰JAML表达可以减少早期和晚期斑块内的脂质含量和巨噬细胞浸润,增加平滑肌细胞以及胶原含量,最终降低斑块的易损指数,稳定斑块；免疫组织化学染色显示JAML基因缺陷可以明显减轻斑块组织中炎症因子IL-6、TNF-α的表达和NF-κB信号通路的激活。3.体外实验进一步验证了JAML在斑块组织内的细胞定位；用oxLDL或TNF-α刺激巨噬细胞,JAML蛋白表达呈现明显的浓度和时间依赖性的升高,但LPS对JAML的表达量无明显影响。进一步实验结果显示,下调巨噬细胞JAML的表达水平,可明显降低oxLDL刺激所导致的IL-6、TNF-α的mRNA水平的升高,但是对IL-1p、MCP-1、IL-10的mRNA水平的影响无统计学差异；另外,干扰JAML蛋白表达也可以抑制NF-κB信号通路的活化。结论与创新性：1.首次检测了JAML在AS斑块中的表达和细胞定位。证实了JAML在AS斑块中表达升高,且主要在巨噬细胞中表达,在内皮细胞和平滑肌细胞中也有少量表达,提示JAML有可能参与了AS斑块内多种细胞成分的功能调节。2.首次证明了JAML促进AS的发生和发展过程,因此,下调JAML的表达可以抑制AS斑块的形成,减轻斑块中的炎症反应,增加晚期AS斑块的稳定性。3.初步探讨了JAML促进AS发生和发展的机制,验证了JAML可以加重AS斑块中巨噬细胞的功能紊乱,导致巨噬细胞分泌炎症因子增多及NF-κB信号通路的活化。综上所述,本课题一方面将为防治AS提供新的药物治疗靶点,揭示针对JAML的靶向治疗有可能成为临床防治AS特别是抗炎治疗的新的治疗策略；另一方面,JAML作为一种分泌性蛋白将有可能作为AS斑块早期诊断和晚期稳定性监测的重要指标。