Girdin对恶性胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

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目的:Girdin是2005年新发现的肌动蛋白结合蛋白,它能够募集并联结、调控细胞内微丝,具有调节细胞生长、迁移、血管生成及自噬等功能。细胞迁移不仅在细胞重要生理活动中起作用,同时也是肿瘤发生、发展等病理过程中的重要步骤和关键环节。目前有研究报道,Girdin蛋白在促进肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用,为进一步探索Girdin蛋白与肿瘤细胞迁移和侵袭的作用机制,本研究着眼于Girdin在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的功能并阐明其相关分子机制,全面了解Girdin蛋白的功能为临床治疗恶性胶质瘤提供新的靶点。方法:第一部分:1、在PCDH-P-Vector载体的基础上构建PCDH-P-Girdin过表达慢病毒表达质粒,利用HEK-293T细胞包装慢病毒。2、慢病毒感染恶性胶质瘤细胞株LN229,提高Girdin蛋白的表达水平;通过Western Blotting技术验证其表达效率,并筛选出稳定表达的克隆。3、利用生长曲线分析Girdin过表达对胶质瘤细胞增殖能力的影响。4、划痕实验检测Girdin过表达对恶性胶质瘤细胞运动能力的影响。5、粘附实验检测Girdin过表达对恶性胶质瘤细胞粘附能力的影响。6、体外侵袭实验检测Girdin过表达对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。第二部分:1、采用小RNA干扰技术降低恶性胶质瘤细胞株LN229和U87中Girdin蛋白的表达水平,通过Western Blotting技术验证其降表达效率,并筛选出稳定降表达的克隆。2、采用划痕实验、趋化运动实验和趋化动力学实验检测Girdin降表达对恶性胶质瘤细胞的运动能力的影响。3、采用肌动蛋白聚合实验检测EGF刺激不同时间后Girdin降表达对细胞骨架蛋白actin聚合能力的影响。4、采用粘附实验检测Girdin降表达对恶性胶质瘤细胞粘附能力的影响。5、采用Western Blotting技术检测Girdin降表达粘附相关蛋白FAK和integrin β1的磷酸化水平的变化;同时用Western Blotting技术检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶(MMP-9)的表达水平,验证Girdin降表达对恶性胶质瘤细胞基质金属蛋白酶的表达·水平的影响。6、体外侵袭实验检测Girdin降表达对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。结果:第一部分:1、与对照组相比,Girdin过表达后,恶性胶质瘤细胞LN229的增殖能力无明显变化。2、与对照组相比,Girdin蛋白过表达导致LN229细胞的迁移能力显著增强(P<0.05)。3、与对照组相比,Girdin蛋白过表达导致LN229细胞的粘附能力显著增强(P<0.05)。4、体外细胞侵袭实验结果显示,Girdin过表达后LN229细胞的侵袭能力较对照组细胞显著增强(P<0.01)。第二部分:1、与对照组相比,Girdin降表达后胶质瘤细胞LN229的迁移能力和趋化运动能力较对照组细胞显著下降(P<0.05)。2、与对照组相比,Girdin降表达导致LN229细胞的F-actin聚合能力明显下降(P<0.05)。3、与对照组相比,Girdin降表达后导致LN229和U87细胞的粘附能力显著降低(P<0.05)。同时Western Blotting结果显示磷酸化的integrinβ1及FAK表达水平较对照组降低。4、体外细胞侵袭实验结果显示,与对照组相比,Girdin降表达后细胞的侵袭能力较对照组细胞显著减弱(P<0.05)。同时与细胞侵袭相关的MMP-2和MMP-9的表达也明显降低。结论:1、Girdin可能是通过调节恶性胶质瘤细胞骨架重塑进而参与调控恶性胶质瘤细胞的迁移过程。2、Girdin可能是通过改变integrin β1及FAK的磷酸化水平而调控恶性胶质瘤细胞的粘附能力。3、Girdin影响恶性胶质瘤细胞向细胞外基质侵袭的过程可能是通过调节MMP-2和MMP-9的表达来实现的。
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