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梨（Pyrus L.）是蔷薇科（Rosaceae）落叶植物,梨花芽会在冬季进入休眠以适应外界不良环境,并需经历一定有效低温方可萌动。ABA是促进休眠深化、抑制休眠解除的重要物质,其含量变化主要受其合成、分解代谢的调控。本试验以‘黄花梨’、‘蜜雪梨’为试材,分析需冷量不同梨品种花芽休眠期间ABA的变化,及ABA合成、分解途径关键酶基因（PpNCEDs、PpCYP707As）的特性,主要结果如下:1梨花芽休眠期间ABA含量的变化运用HPLC测定‘黄花梨’、‘蜜雪梨’花芽休眠过程中ABA含量的变化。休眠期间‘黄花梨’、‘蜜雪梨’花芽内ABA含量变化趋势相似,呈波浪形变化,‘黄花梨’有4次ABA含量变化高峰,‘蜜雪梨’有3次;‘蜜雪梨’花芽内ABA的含量高于‘黄花梨’;‘黄花梨’、‘蜜雪梨’花芽内ABA含量在休眠解除前同为下降,在休眠解除过程中分别为增加和先增后降,在休眠解除后又同为增加。试验结果表明,需冷量不同梨品种花芽休眠期间ABA含量的变化有差异,ABA含量下降是梨花芽休眠解除的必要条件之一,ABA还可能参与梨对低温的应答,单一ABA含量变化趋势不能作为梨花芽休眠进程的判断依据。2梨PpNCEDs、PpCYP707As的生物信息学特点参照NCBI上蔷薇科ABA代谢途径关键酶基因NCED、CYP707A的序列,采用本地blast的方法,从梨基因组数据中搜索到梨NCED、CYP707A的CDS序列,并从‘黄花梨’、‘蜜雪梨’上均克隆到3个NCED基因,命名为PpNCED1、PpNCED2、PpNCED3,已登录NCBI;均克隆到5个CYP707A基因,命名为PpCYP707A1、PpCYP707A2、PpCYP707A3、PpCYP707A4、PpCYP707A5,已登录NCBI。‘黄花梨’与‘蜜雪梨’PpNCEDs、PpCYP707As基因序列的相似度较高,在蔷薇科植物的同源基因系统进化树上,‘黄花梨’、‘蜜雪梨’、‘酥梨’（梨基因组）的相关基因优先聚类,再与苹果相应基因聚类,同植物学分类关系一致。PpCYP707A家族的PpCYP707A4、PpCYP707A5相似度极高,分别与苹果的两个基因（XP008346457.1、XP008382035.1）单独聚类,而非PpCYP707A4和PpCYP707A5独自聚类,它们的生物学信息较为接近,可能产生于梨和苹果的共同祖先,且保守性很强。运用生物信息学方法分析‘黄花梨’PpNCEDs、PpCYP707As编码蛋白性质。PpNCEDs蛋白含有 1 个保守结构域,为PLNO2258;PpNCED1、PpNCED2、PpNCED3蛋白的氨基酸组成数量分别为617、613、607,均为不稳定、亲水蛋白。PpCYP707As蛋白含有1个保守结构域,为PLN02196;PpCYP707A1、PpCYP707A2、PpCYP707A3、PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的氨基酸组成数量分别为452、451、479、476、474,PpCYP707A1蛋白属稳定、亲水蛋白,其余4个PpCYP707As蛋白均为不稳定、亲水蛋白。氨基酸组成数量、含量的不同决定了PpNCEDs、PpCYP707As各成员的蛋白质理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、磷酸化修饰、蛋白卷曲螺旋结构、二级结构、三维结构等方面信息均不同。3梨花芽休眠期间PpNCEDs、PpCYP707As的表达分析运用荧光定量PCR测定了休眠期间‘黄花梨’、‘蜜雪梨’花芽内PpNCEDs、PpCYP707As的相对表达量。‘黄花梨’、‘蜜雪梨’花芽休眠期间PpNCEDs、PpCYP707As各基因的表达量变化趋势均呈波浪形变化,但不完全相同。2012、2013两年秋冬休眠期,‘黄花梨’花芽内PpNCEDs、PpCYP707As的表达量变化趋势均与ABA含量相似,但各基因表达量高峰的时间点不一致。‘蜜雪梨’花芽内仅PpNCED1、PpCYP707A3的表达量变化趋势同ABA含较为相似,但表达高峰时间点不同于ABA含量高峰;PpNCED2、PpCYP707A1、PpCYP707A2的表达量变化趋势仅在花芽萌动期与ABA一致;而PpNCED3的表达变化趋势则不同于ABA。试验结果表明,PpNCEDs与PpCYP707As以一种协调关系共同调控ABA含量;PpCYP707As负反馈调节ABA含量,该负反馈调节存在时空特异性和品种间差异,且PpCYP707As的表达并非完全受制于ABA。寒流来袭导致花芽内ABA含量升高,而PpNCEDs、PpCYP707As的表达量均上调,说明寒流来袭PpNCEDs对ABA含量起主要调节作用。休眠解除临界期前ABA含量下降,‘黄花梨’花芽内PpCYP707A2表达量上调、其他基因表达量下降,‘蜜雪梨’花芽内PpNCEDs、PpCYP707As的表达量同为下降,说明此时‘黄花梨’花芽内PpCYP707A2、‘蜜雪梨’花芽内PpNCEDs对ABA含量起主要调节作用;休眠解除完全期前,‘蜜雪梨’的ABA含量下降,PpCYP707A1、PpCYP707A2的表达量升高、PpNCEDs的表达量均升高、PpCYP707A3的表达量下降,说明此时PpCYP707A1、PpCYP707A2对ABA含量起主要调节作用。短低温梨品种‘蜜雪梨’ABA含量调节机制与花芽休眠机制关系同‘黄花梨’有差异。4梨PpNCEDs和PpCYP707As基因启动子的元件分析从‘黄花梨’上克隆到PpNCED1、PpNCED2、PpNCED3;PpCYP707A1、PpCYP707A2、PpCYP707A3的启动子序列。分析ATG前1500bp启动子区域的作用元件,PpNCEDs、PpCYP707As的启动子区域含ACE、G-Box、AE-box等21类光响应元件,ABRE、GARE、TGA-element等6类激素响应元件及其他6类元件,众多元件中有4类元件可被bZIP类转录因子识别。试验结果表明,PpNCEDs、PpCYP707As的表达可能与光响应调控、激素平衡有关,还受bZIP类转录因子的调控。5PpNCED1、PpCYP707A1、PpCYP707A2 的原核表达采用原核表达体系表达‘黄花梨’的PpNCED1、PpCYP707A1、PpCYP707A2蛋白。以 pEASY-Blunt E1 作为连接载体,构建 pEASY-PpNCED1、pEASY-PpCYP707A1、pEASY-PpCYP707A2等原核表达载体,将表达载体转入BL21（DE3）中,获得表达菌株BL21（DE3）-pEASY-PpNCED1、BL21（DE3）-pEASY-PpCYP707A1、BL21（DE3）-pEASY-PpCYP707A2。1mol/l IPTG 诱导菌株表达 6h 后,进行SDS-PAGE分析,BL21（DE3）-pEASY-PpCYP707A1、BL21（DE3）-pEASY-PpCYP707A2表达出目的蛋白,BL21（DE3）-pEASY-PpNCED1未能表达出目的蛋白。