论文部分内容阅读
一、研究背景2019年底,由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus disease 2019,COVID-19）在人间传播并引起了全球大流行。SARS-CoV-2具有传染性强、传播速度快、传播范围广的特点,对人类健康和世界公共卫生安全构成了重大威胁。长期来看,通过大规模疫苗接种建立群体免疫是最可能成功控制疫情的核心,而自然感染或接种疫苗免疫力维持时间对疫苗的设计和研发以及未来疾病流行严重程度至关重要。然而,关于人感染SARS-CoV-2后机体免疫力持久性依然不清楚。病毒感染引起的机体免疫应答,包括体液和细胞免疫应答,与病毒清除、疾病严重程度、疫苗反应和针对未来感染的保护密切相关。特别是病毒特异性中和抗体的持久性,可以指导疫苗的设计与评估。此外,由病毒感染诱导的适应性免疫应答与保护机体免受后续病毒的再次感染密切相关。然而,人感染SARS-CoV-2特异性抗体动态变化特征及持久性、T细胞动力学、以及记忆性细胞免疫应答的研究有限。因此,系统开展自然感染后机体记忆性免疫应答的研究,具有紧迫性和必要性,研究结果可为疫苗的研制和疫情防控措施的制定提供科学依据。二、研究目的通过开展SARS-CoV-2感染患者感染后不同时间点病毒特异性抗体和记忆性T和B细胞的研究,掌握SARS-CoV-2感染后抗体应答的动力学规律,阐明病毒记忆性T细胞和B细胞免疫应答特征及持久性,为疫苗设计和疫情防控提供重要的科学依据。三、研究方法本研究结合横断面和前瞻性队列研究设计,于中国山东、江苏和浙江纳入经实验室确诊的SARS-CoV-2感染者和新冠肺炎大流行前一般健康对照人群为研究对象。获得研究对象知情同意后,采集SARS-CoV-2感染后急性期至感染后3个月、6个月、9个月和14个月血液标本,分离血清和外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,同时收集研究对象人口学基本信息、流行病学资料和临床信息。采用酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清样本中免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,IgM）和免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）抗体;通过替代病毒中和实验（Surrogate virus neutralization test,s VNT）、假病毒中和实验（Pseudovirus neutralization test,p VNT）和活病毒中和实验（Live virus-based neutralization test,LVNT）检测血清中和抗体（Neutralizing antibody,NAb）;利用酶联免疫斑点实验（Enzyme linked immunospot assay,ELISpot）和流式细胞术（Flow cytometry,FC）检测PBMCs样本中SARS-CoV-2特异性记忆T和B细胞。运用Microsoft excel建立数据库,利用Graph Pad Prism 8.0进行数据分析和绘图。分类变量资料的比较采用χ~2检验或Fisher确切概率法。采用Mann-Whitney U检验和Wilcoxon配对符号秩检验分别对两组独立样本和配对样本抗体滴度和记忆性T和B细胞数量进行比较;采用Kruskal-Wallis检验和Friedman检验分别对多个独立样本和多个配对样本的抗体滴度和记忆性T和B细胞数量进行比较,并用错误发现率（False discovery rate,FDR）进行校正。相关性检验采用Spearman秩相关。所有检验均为双侧检验,P＜0.05认为有统计学差异。四、研究结果（1）SARS-CoV-2感染急性期至感染后3个月抗体及T细胞动力学通过建立疫情早期25例SARS-CoV-2感染患者的前瞻性队列,采集其感染后1～7天、8～14天、15～21天、28天和3个月不同时间节点共计112份血清样本及感染后3个月20份PBMCs样本,对病毒特异性抗体和T细胞应答进行检测。血清中受体结合结构域（Receptor-binding domain,RBD）蛋白特异性IgM（RBD-IgM）抗体在SARS-CoV-2感染后1周的阳性率为33.3%,感染后2周所有患者RBD-IgM抗体阳性,感染后15～21天抗体水平达到峰值,感染后3个月阳性率为75%,且抗体水平迅速下降。与RBD-IgM抗体相似,感染后1周血清核衣壳（Nucleocapsid,N）蛋白特异性IgG（N-IgG）抗体阳性率为33.3%,感染后15～21天抗体水平达到峰值,感染后2周至3个月,抗体阳性率为100%。刺突（Spike,S）蛋白特异性IgG（S-IgG）抗体在感染后1周的阳性率为16.7%,感染后28天S-IgG抗体达到峰值,几何平均滴度（Geometric mean titer,GMT）为7014.6,感染后3个月S-IgG抗体阳性率为100%,GMT为4345.1;RBD-IgG抗体在感染后1周内阳性率为8.3%,感染后28天达到峰值,GMT为4036.5,感染后3个月RBD-IgG抗体阳性率为95%,GMT为1513.6。血清中和抗体在感染后15～21天达到峰值,GMT为1280,感染后3个月中和抗体阳性率为85%,GMT为697.9。通过对感染后3个月特异性T细胞流式检测,发现50%和15%的感染者可分别检测到S蛋白特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,65%和10%的感染者分别检测到N蛋白特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞;IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+记忆T细胞主要为效应记忆性T细胞和终末分化效应T细胞。（2）SARS-CoV-2感染后6个月记忆性免疫应答采用横断面研究设计,通过对481例SARS-CoV-2感染后6个月的康复患者血清抗体和T细胞免疫应答进行分析发现,感染后6个月RBD-IgM、N-IgG和S-IgG抗体的阳性率分别为37.0%、93.6%、95.6%。替代病毒中和抗体和假病毒中和抗体的阳性率分别为68.8%和88.4%,平均中和抑制率和假病毒中和抗体GMT分别为42.03%和235.5。通过对随机选取的105份PBMCs样本进行病毒特异性T细胞应答检测,发现大多数康复患者在感染后6个月存在抗原特异性CD4+和CD8+T细胞,并且CD4+T细胞反应相对更强。超过80%的特异性T细胞以肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）和白细胞介素2（Interleukin2,IL-2）为主。大多数康复患者能检测到SARS-CoV-2特异性记忆CD4+和CD8+T细胞反应,其中CD4+T细胞主要为效应记忆T细胞和中央记忆T细胞,记忆CD8+T细胞表型主要为效应T细胞和效应记忆T细胞。该部分研究表明,SARS-CoV-2感染后6个月,绝大多数康复患者仍能检测到病毒特异性抗体和记忆性T细胞免疫应答,且抗体和T细胞应答保持在较高水平。（3）SARS-CoV-2感染后9个月记忆性免疫应答采用横断面研究设计,对59例SARS-CoV-2感染后9个月康复患者血清抗体和T细胞免疫应答进行分析,发现98.3%的康复患者血清中检测到N-IgG抗体;55.9%的患者血清可检测到RBD-IgG抗体,但抗体水平较低,GMT小于500;93.2%的患者可检测到S-IgG抗体;66.1%和89.8%能够检测到替代病毒中和抗体和假病毒中和抗体,但中和抗体较低,平均中和抑制率和假病毒中和抗体的GMT分别为46.4%和66.1。感染后9个月,74.6%和71.2%的康复患者可检测到分泌RBD特异性IgG抗体的记忆B细胞和分泌γ干扰素（Interferon gamma,IFN-γ）的T细胞。SARS-CoV-2特异性记忆B细胞与RBD-IgG抗体（r=0.350,P=0.007）、S-IgG抗体（r=0.330,P=0.01）和中和抑制率（r=0.456,P＜0.001）存在相关性。女性康复患者S-IgG抗体水平高于男性,年龄、性别和基础性疾病与抗体无显著差异。60岁以上康复患者分泌RBD特异性IgG的记忆B细胞数量显著低于60岁以下康复患者,年龄、性别和基础性疾病与特异性T细胞免疫应答无显著差异。（4）SARS-CoV-2感染后14个月抗体和T细胞持久性采用横断面和前瞻性随访研究设计,纳入545例SARS-CoV-2感染后14个月的康复患者,其中253例为SARS-CoV-2感染后6个月纳入的康复患者。通过对血清特异性抗体横断面分析发现,感染后14个月,N-IgG抗体阳性率为88.1%,S-IgG抗体阳性率为91.0%,GMT为203.6;61.8%和70.6%的康复患者可检测到替代病毒中和抗体和假病毒中和抗体,平均中和抑制率和假病毒中和抗体GMT分别为34.8%和127.6。通过对感染后6个月和14个月血清特异性抗体纵向分析发现,感染后14个月IgG、IgM以及中和抗体水平显著降低,其中S-IgG抗体滴度下降了5.6倍（P＜0.0001）,假病毒中和抗体GMT下降了4.2倍（P＜0.0001）。不同严重程度病例组间无统计学差异。此外,通过对感染后6个月和感染后14个月血清对Omicron中和活性分析,发现感染后6个月,25%和29%的康复患者可检测到针对Omicron BA.1和BA.2的中和抗体,GMT分别为19.4和19.2,对Omicron BA.1和BA.2的中和能力相比SARS-CoV-2野生株的中和能力分别下降了25.9倍和26.1倍（P＜0.0001）;感染后14个月有8%和21%的康复患者Omicron BA.1和BA.2中和抗体检测阳性,GMT分别为11.3和15.8,相比于SARS-CoV-2野生株,对Omicron BA.1和BA.2变异株的中和能力分别下降了10.9倍和7.8倍（P＜0.0001）。通过对随机选取的63份PBMCs样本进行病毒特异性T细胞应答检测,发现大多数康复患者在感染后14个月可以检测到抗原特异性活化的CD4+和CD8+T细胞和IFN-γ+和TNF-α+CD4+、CD8+T细胞。五、研究结论SARS-CoV-2感染后IgG和NAb抗体应答可持续至少14个月,但抗体滴度较低,感染后14个月对Omicron变异株几乎没有中和能力;超过70%的康复患者病毒特异性B细胞应答可维持近1年,50%以上的患者病毒特异性T细胞至少维持14个月,为预防再感染和疫苗接种策略提供了依据。