结肠癌(colon cancer)是较为常见的消化道恶性肿瘤之一,具有治疗难度大、发病率高及死亡率高等特点。结肠癌的发病率在消化道肿瘤中位于第2位,并且在全球范围内呈现逐渐攀升趋势。对于早期或局部转移患者,如果能获得根治性手术的机会,预后一般较好;对于晚期患者,常常丧失根治性手术的机会,而是采用放疗、化疗、对症支持治疗等治疗手段,预后一般较差。因此,安全、有效的治疗策略对于结肠癌治疗来说是很有必要的。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy)是肿瘤免疫治疗的重要手段之一。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)是一类经过整合嵌合抗原受体(chimeric Antigen Receptor,CAR)基因修饰,能够特异性消灭肿瘤细胞的免疫细胞。CAR可以特异性识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)或者肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen,TSA),随后将信号传递至T细胞,引起T细胞激活和增殖,从而有效杀伤肿瘤细胞。2017年美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)已经先后批准了诺华制药公司的CAR-T药物Kymriah和Kite制药公司的Yescarta上市,用于血液系统疾病的治疗并取得了惊人成绩。近年来的研究发现,CAR-T免疫疗法对实体瘤也有一定的治疗效果。NKG2D(natural killer group 2 member D)是NK细胞凝集素样受体家族Klrk1基因编码的一种重要激活受体。它主要存在于小鼠和人的NK细胞上,在人的CD8~+T细胞上组成性表达,但仅在小鼠T细胞活化时表达。人类NKG2D能够识别多种高度多样化的配体,包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、ULBP5和ULBP6等。一般情况下,NKG2D配体在正常细胞上是不存在的,但可以被各种刺激所诱导。在肿瘤细胞上,NKG2D配体与NKG2D结合,随后激活NK细胞并参与免疫细胞介导的杀伤作用。由此可见,NKG2D配体可以作为CAR-T细胞治疗的高效靶蛋白。在本研究中,我们将利用非病毒微环DNA载体构建NKG2D CAR,并将其转染T细胞,获得第三代NKG2D CAR-T细胞,并探讨该细胞对人结肠癌细胞的体外、体内杀伤作用。非病毒载体可以避免病毒复制、细菌复制等风险,具有很好的安全性。因此,本研究将为结肠癌乃至其他实体瘤的治疗提供新的作用靶点和思路,具有重要的临床应用价值。第一部分:NKG2D嵌合抗原受体T细胞的制备和功能检测目的:构建嵌合抗原受体NKG2D CAR微环DNA,制备和验证NKG2D CAR-T细胞。方法:根据参考文献和Genebank,确定NKG2D CAR的氨基酸序列。按照CD8α信号肽序列、人NKG2D胞外区序列、人CD8α铰链区序列、人CD28跨膜区序列和胞内区序列、人4-1BB胞内信号序列、人CD3ζ胞内信号序列的顺序确定NKG2D CAR的结构。此外,分别将EcoRI和BamHI两个酶切位点放置在整段NKG2D CAR基因序列的前端和后端,形成NKG2D CAR的全基因序列。合成NKG2D CAR全基因序列,并连接到pUC57大肠杆菌基因克隆质粒中,命名为NKG2D CAR-pUC57质粒。对NKG2D CAR-pUC57进行EcoRI和BamHI双酶切,使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,回收NKG2D CAR片段。将NKG2D CAR片段与亲本微环DNA进行连接反应后,转化到特殊感受态菌ZYCY10P3S2T E.coli中,在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养。挑取2个单克隆菌落,摇菌,提取NKG2D CAR微环DNA质粒。对质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。利用密度梯度离心法从人外周血中分离出T淋巴细胞,采用电穿孔法将NKG2D微环DNA质粒转到T淋巴细胞中,获得NKG2D CAR-T细胞。每隔2天传代或换液一次,换液前进行细胞计数。利用台盼蓝染色计算细胞存活率,利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况,利用共聚焦显微镜观察细胞的NKG2D和GFP表达情况以及细胞定位,利用流式细胞术观察细胞的NKG2D和GFP表达情况,利用Western blotting检测细胞的CD3ζ表达情况,利用流式细胞仪检测细胞中CD4~+和CD8~+细胞亚群的比例。结果:1.琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,凝胶中可见一个约1200bp大小的条带,条带大小与实验设计的NKG2D CAR一致,此即为NKG2D CAR片段,提示NKG2D CAR-pUC57质粒构建成功。2.倒置培养过夜后,LB固体培养基中肉眼可见密布的单克隆菌落,提示NKG2D CAR亲本微环DNA质粒顺利转化到感受态细菌中,获得卡那霉素抗性。3.提取2个单克隆菌落质粒,双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,二号单克隆菌落所提质粒呈现一个约1200bp大小的条带,条带大小与实验设计的NKG2D CAR一致,提示二号菌落所提取得NKG2D CAR微环DNA质粒包含NKG2D CAR片段,NKG2D CAR微环DNA质粒构建成功。基因测序结果显示,NKG2D CAR微环DNA中的目的片段未发生基因突变,并包括完整基因序列。4.经过FICOLL分离液处理后,每个人外周血去白细胞过滤器可以获得3×10~6至5×10~6个淋巴细胞。倒置显微镜下观察可见,淋巴细胞悬浮生长,呈圆形或椭圆形;另有少量体积较大、形态不规则细胞呈贴壁生长。细胞培养12h之后,淋巴细胞开始聚集成团、形成增殖集落;同时,体积较大、形态不规则细胞的数量明显减少。5.电转后,台盼蓝染色结果显示,正常T细胞的存活率达97%,NKG2D CAR-T细胞的存活率达76%。由此可见电穿孔法对细胞的存活率有一定影响。6.细胞计数结果显示,正常T细胞和NKG2D CAR-T细胞在培养12天后显示出相似的扩增率,扩增比例均达到5-6倍;此外,NKG2D CAR-T细胞在第2-4天的数量显著下降,这可能是电穿孔导致的细胞损伤。7.荧光显微镜观察结果显示,GFP在NKG2D CAR微环DNA载体转染T细胞后电转24h开始出现明显表达,转染后48h达到高峰表达,并至少持续到72h以上。8.共聚焦显微镜检测结果显示,NKG2D和GFP在CAR-T细胞中的表达明显强于正常对照组T细胞,而且NKG2D蛋白主要定位于细胞膜和胞浆,提示NKG2D CAR可以顺利折叠并与T细胞膜特异性结合。9.Western blotting检测结果显示,NKG2D CAR-T细胞和正常对照组T细胞均具有内源性CD3ζ表达,但是NKG2D CAR-T细胞还有外源性CD3ζ表达,而正常对照组T细胞无外源性CD3ζ表达。10.流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组T细胞相比,CD4~+的NKG2D CAR-T细胞比例略有升高,CD8~+的NKG2D CAR-T细胞比例略有降低。小结:1.通过基因重组技术,成功制备了NKG2D CAR微环DNA质粒。2.通过电穿孔技术,成功地将NKG2D CAR微环DNA质粒转到人外周血淋巴细胞中并在体外培养、扩增,成功获得NKG2D CAR-T细胞。3.人结肠癌细胞LS174T表达高水平的MICA和ULBP-3,HCT-116细胞表达高水平的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3。第二部分:NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体外研究目的:观察CAR-T细胞的功能及对人结肠癌细胞株的体外杀伤作用。方法:复苏人结肠癌细胞株LS174T和HCT-116到细胞培养瓶中,加入含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态,待细胞充分贴壁后,每2天更换一次培养基。细胞贴壁生长至90%融合度时,根据1:3-1:4的扩增倍数,采用胰蛋白酶EDTA消化法进行细胞传代。使用流式细胞仪检测MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2/5/6和ULBP-3等NKG2D配体在人结肠癌细胞株LS174T和HCT-116的表达情况。将正常T细胞或NKG2D CAR-T细胞分别与LS174T或HCT-116细胞按照5:1、10:1和20:1的效应细胞:靶细胞比例(effector:target cell ratios,E:T)共同培养24h,使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit),分别检测NKG2D CAR-T细胞对LS174T和HCT-116的细胞毒性。此外,使用酶联免疫吸附检测试剂盒(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),分别检测NKG2D CAR-T与LS174T或HCT-116结肠癌共培养时IL-2和IFN-γ等细胞因子的释放情况。结果:1.流式细胞仪检测结果显示,人结肠癌细胞LS174T表面的MICA和ULBP-3高表达,MICB、ULBP1和ULBP-2/5/6低表达。2.流式细胞仪检测结果显示,人结肠癌细胞HCT-116表面的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3高表达,ULBP1低表达。3.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示,与正常对照T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞对LS174T细胞在各E:T均表现出更强的杀伤作用。当E:T为20:1时,NKG2D CAR-T细胞对LS174T的杀伤效果最佳,杀伤率达到47%。4.乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果显示,与正常对照T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞对HCT-116细胞在各E:T均表现出更强的杀伤作用。当E:T为20:1时,NKG2D CAR-T细胞对HCT-116的杀伤效果最佳,杀伤率达到52%。5.ELISA检测结果显示,与正常对照组T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞能释放出大量IL-2。其中,NKG2D CAR-T细胞与LS174T细胞共培养24h,培养基中IL-2的浓度达到为3265.83±840.45pg/mL;NKG2D CAR-T细胞与HCT-116细胞共培养24h,培养基中IL-2的浓度达到为4855.71±1166.61pg/mL。6.ELISA检测结果显示,与正常对照组T细胞相比,NKG2D CAR-T细胞能释放出大量IFN-γ。其中,NKG2D CAR-T细胞与LS174T细胞共培养24h,培养基中IFN-γ的浓度达到为8621.43±1594.91pg/mL;NKG2D CAR-T细胞与HCT-116细胞共培养24h,培养基中IFN-γ的浓度达到为10757.14±2163.74pg/mL。小结:1.体外研究结果显示,NKG2D CAR-T细胞对人结肠癌细胞LS174T和HCT-116均具有良好的杀伤作用,且杀伤效率与效靶比呈正相关。2.NKG2D CAR-T细胞能够分泌大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。第三部分:NKG2D嵌合抗原受体T细胞对人结肠癌细胞杀伤作用的体内研究目的:建立HCT-116异种移植NOD/SCID小鼠模型,观察NKG2D CAR-T细胞在体内对人结肠癌细胞杀伤作用。方法:复苏人结肠癌细胞HCT-116-Luc到培养瓶中,加入含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察结肠癌细胞的形态,待细胞充分贴壁后,每2天更换一次培养基。细胞贴壁生长至90%融合度时,根据1:3-1:4的扩增倍数,采用胰蛋白酶EDTA消化法进行细胞传代。向刚刚传代的人结肠癌细胞株HCT-116-Luc的培养基中加入潮霉素B溶液,经过3-4次传代,筛选具有潮霉素B抗性的HCT-116-Luc细胞。在无特定病原体动物(Specific Pathogen Free,SPF)级动物实验室饲养雄性NOD/SCID小鼠(non-obese diabetic/severe-combined immunodeficient mice,非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠),于小鼠右肩背皮下注射HCT-116-Luc肿瘤细胞悬液(1×10~6个/只),建立小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。当肿瘤负荷达到150-250mm~3时,根据肿瘤体积大小和体重,结合实验设计方案,将小鼠随机分为3组:(1)正常对照组(control group):NOD/SCID小鼠5只,正常饲养,分别于治疗第0天和第7天给予PBS注射、干预;(2)T细胞治疗组(T cells group):NOD/SCID小鼠5只,分别于治疗第0天和第7天给予正常T细胞治疗、干预;(3)NKG2D CAR-T细胞治疗组(NKG2D CAR-T cells group):NOD/SCID小鼠5只,分别于治疗第0天和第7天给予NKG2D CAR-T细胞治疗、干预。治疗期间观察小鼠精神状态、毛发情况以及是否存在腹泻、治疗后过敏反应等情况,记录小鼠生存时间。每5天记录一次小鼠体重和肿瘤体积,绘制小鼠体重及肿瘤生长曲线。于治疗后第20天,利用小鼠活体成像仪分析观察肿瘤生长情况。于治疗第25天,处死小鼠,切取、称量肿瘤以及心、肝、肺、脾、肾等重要器官、组织,置于4%多聚甲醛通用型组织固定液,用于免疫组化检测和常规苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)。结果:1.通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc,成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型,12天全部成瘤。将小鼠分为正常对照组、T细胞治疗组和NKG2D CAR-T细胞治疗组。2.体重测量结果显示,治疗期间,正常对照组小鼠体重略有升高,T细胞治疗组小鼠体重变化不明显,但是NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠体重有所下降。3.活体动物成像结果显示,与正常对照组和T细胞治疗组相比,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤生长受到明显抑制。4.游标卡尺测量结果显示,治疗期间,正常对照组、T细胞治疗组小鼠的肿瘤体积进一步快速增加,但是NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤体积增加速度明显减缓。5.生存时间记录结果显示,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠生存时间长于正常对照组和T细胞治疗组。6.免疫组织化学检测结果显示,与正常对照组和T细胞治疗组相比,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的肿瘤组织周围有大量淋巴细胞浸润。7.HE染色检测结果显示,NKG2D CAR-T细胞治疗组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织切片均未发现明显的形态学改变,具有很好的安全性。小结:1.通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc,成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。2.NKG2D CAR-T细胞治疗导致小鼠体重下降、生存时间延长,肿瘤生长受到抑制。3.NKG2D CAR-T细胞能够浸润到小鼠的肿瘤组织周围,未导致心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等重要脏器的形态学改变,具有很好的安全性。结论:1.通过基因重组技术,成功制备了NKG2D CAR微环DNA质粒。通过电穿孔技术,成功地将NKG2D CAR微环DNA质粒转到人外周血淋巴细胞中并在体外培养、扩增,成功获得NKG2D CAR-T细胞。2.人结肠癌细胞LS174T表达高水平的MICA和ULBP-3,HCT-116细胞表达高水平的MICA、MICB、ULBP-2/5/6和ULBP-3。3.体外研究结果显示,NKG2D CAR-T细胞对人结肠癌细胞LS174T和HCT-116均具有良好的杀伤作用,且杀伤效率与效靶比呈正相关;同时NKG2D CAR-T细胞能够分泌大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。4.体内研究结果显示,通过向NOD/SCID小鼠右肩背部皮下注射人结肠癌细胞HCT-116-Luc,成功构建小鼠皮下结肠癌移植瘤模型。NKG2D CAR-T细胞治疗导致小鼠体重下降、生存时间延长,肿瘤生长受到抑制。NKG2D CAR-T细胞能够浸润到小鼠的肿瘤组织周围,未导致心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等重要脏器的形态学改变,具有很好的安全性。