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表皮葡萄球菌是引起奶牛隐性乳房炎的重要条件致病菌之一。由表皮葡萄球菌为主形成的生物膜结构,能够增强致病菌在乳腺上皮细胞表面的黏附定植能力,促使致病菌不断向外界释放毒力因子。使用大剂量传统抗生素作为临床治疗的首选药物,生物膜为膜内致病菌提供保护屏障,阻碍药物与细胞作用靶点结合,加剧了多重耐药菌株的产生,从而引起奶牛乳房炎不断发作而且很难根治。因此,筛选抑制生物膜形成的抑制剂迫在眉睫。放线菌是获得丰富和多样性次生代谢产物的宝库。基于前期研究基础上,放线菌TRM 41337发酵液对表皮葡萄球菌ATCC 35984有较强的活性,因此对其展开了研究。(1)对放线菌TRM 41337的发酵条件进行了优化,分别采用单因素、Plackeett-Burman实验、响应面设计实验优化放线菌TRM 41337抑制表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜形成能力的影响,确定了对表皮葡萄球菌ATCC 35984相对生物膜形成能力影响最大的培养基为:淀粉20g/L、酵母浸粉1g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.38g/L、pH为9.0。最佳发酵条件为:发酵温度25℃、摇床转速180 r/min、装液量150 mL(500 mL摇瓶)、接种量10%、发酵时间10 d,采用微孔板半定量法追踪最优发酵培养基的相对生物膜形成能力,经检测其相对生物膜形成能力仅有18.98%,较优化前培养基将其相对生物膜形成能力降低了10%。(2)通过反复柱层析分离纯化活性蛋白,SDS-PAGE,LC-MS进行鉴定,其鉴定结果为转糖苷酶相关蛋白(transglycosylase-associated protein)。为了进一步探究纯化后蛋白的稳定性,用不同理化因素处理蛋白,实验发现当蛋白偏碱时其对表皮葡萄球菌ATCC 35984相对生物膜形成能力影响最明显,此蛋白对温度并不敏感,具有耐高温的潜质,不同理化因素对蛋白的影响也不明显,因此实验表明此稳定性相对较好。(3)通过牛乳平板实验、细胞表面疏水性实验、胞外DNA及胞外多糖检测,对放线菌TRM 41337抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成机制进行了初步探索。结果表明活性蛋白在碱性条件下相对生物膜形成能力最低为25.74%,高温(100℃)处理后蛋白并没有失活,其相对生物膜形成能力为59.04%,其余理化因素处理蛋白后,对其活性影响并不明显。本实验目的为深入研究TRM 41337抑制表皮葡萄球菌生物膜的活性物质,确定其结构和种类,揭示其抑制机制,为从抗生物膜形成角度防治奶牛乳房炎和研发新药提供理论依据。