超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一种广泛存在于生物体中的金属酶,SOD在抗炎、抗衰老、抗氧化应激、抑制肿瘤、自身免疫疾病方面具有重要的作用。根据分布的不同,真核生物SOD可分为3种:主要分布于胞浆的铜锌超氧化物歧化酶（copper/zinc superoxide dismutase,Cu/Zn-SOD,SOD1）、位于线粒体的锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,MnSOD,SOD2）和位于细胞外基质的细胞外铜锌超氧化物歧化酶（extracellular copper/zincsuperoxide dismutase,EC-SOD,SOD3）,这些酶都具有催化超氧阴离子发生歧化反应的作用,是体内重要的氧自由基清除剂。SOD2主要位于线粒体,而线粒体是细胞内能量产生和氧代谢的重要场所,也是自由基产生的主要场所,由此决定了其在抗氧化损伤中的特殊地位。不同类型SOD在生物体中的表达方式不同,Sod1基因大多是组成型表达,而Sod2基因主要是诱导型表达的。Sod2基因的表达可因细胞受到辐射、氧化剂、细胞因子、炎症介质等刺激而显著提高。小鼠SOD2的编码基因Sod2是单拷贝的核基因。对Sod2启动子的研究发现,Sod2启动子序列缺乏TATA盒、CAAT盒,但转录起始位点上游序列富含GC序列,这些都是管家基因的特点,但受到脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激后Sod2基因表达却明显增加。研究已表明,内毒素可激活肝脏中枯否细胞和中性粒细胞使之发生呼吸爆发,释放大量超氧阴离子,而线粒体正是这一反应的重要场所。SOD2的作用是催化超氧阴离子转变成氧和过氧化氢,后者在过氧化氢酶等的作用下被清除。因此,LPS刺激下Sod2表达增加对于防止氧自由基对机体损伤具有重要作用。而对LPS诱导的Sod2基因表达调控机制的研究对于深入理解SOD2在细胞保护中的作用具有重要意义。目前,关于LPS诱导Sod2基因表达机制的研究报道较少。Visner等报导LPS刺激肺内皮样细胞L2后,Sod2mRNA表达大幅度增加,这种增加可被RNA合成抑制剂一放线菌素D所抑制,故认为LPS至少可在转录水平诱导Sod2表达。目前,关于LPS诱导Sod2表达的具体调控机制尚未阐明。真核生物基因表达是一个高度复杂、精确调控的过程。基因调控发生在复制、转录、转录后等多水平上进行,但转录起始是基因表达调控的基本控制点,即在一定时间、空间特异性的基础上,这一过程是由特异基因的启动子与调节蛋白相互作用来决定的,其实质是DNA—蛋白质/蛋白质—蛋白质间的相互作用对RNA聚合酶活性的影响。另外,人们发现,在基因调控过程中,往往不是单个因素起作用,而是多种调节因素相互交织,相互影响,形成复杂的调控网络,最终使基因表达调控呈现出一种高度的有序性。鉴于这种广泛的蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA相互作用网络参与其中,相关研究策略也层出不穷。其中,启动子DNA结合蛋白的研究是从转录水平上研究基因表达的调控,以寻找新的蛋白质为手段,以了解其转录调节作用机制为目的,从而为最终阐明某些疾病的发病机制及基因治疗打下基础。本研究基于DNA—蛋白质相互作用的原理,利用生物素—链霉亲和素系统进行内毒素血症小鼠Sod2启动子结合差异蛋白的筛选,以期寻找LPS刺激下,参与调节Sod2基因转录表达的转录调节蛋白,为深入理解LPS诱导Sod2基因表达的调控机制奠定理论基础。本课题研究包括以下几个方面:（一） RT-PCR检测LPS对小鼠肝脏组织Sod2 mRNA表达的影响采用RT-PCR方法检测LPS刺激对小鼠肝脏组织Sod2 mRNA表达的剂量效应和时间效应。结果显示,与正常组相比,腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kgLPS组的小鼠肝脏组织Sod2 mRNA表达具有显著差异（F=38.796,P＜0.01）,说明腹腔注射上述剂量的LPS均能增加小鼠肝组织Sod2 mRNA表达。腹腔注射20 mg/kg LPS后1 h、2 h、4 h、6 h,Sod2 mRNA表达均增加,与正常对照组相比具有显著差异（F=40.758,P＜0.01）,4 h增加最为明显。本实验为进一步探讨LPS对Sod2基因表达调控机制奠定了基础,为后续研究内毒素血症中Sod2基因表达提供了良好的动物模型。（二）小鼠Sod2启动子的生物信息学分析应用在线数据库Transcriptional Regulatory Element Database确定小鼠Sod2基因的转录起始位点,并获取转录起始位点上游2000 bp与下游100 bp的DNA片段。将获得的DNA片段在NCBI/BLAST上进行核苷酸序列比对,并在Ensembl上与Sod2基因的5’侧翼序列进行比对,两者比对结果均是100%匹配。应用在线Consite系统对获取DNA片段潜在的转录因子结合位点进行预测,确定Sod2基因转录起点上游1554 bp至下游48 bp启动子序列作为本实验的研究对象。（三）小鼠Sod2启动子的克隆及其活性检测提取小鼠肝组织基因组DNA,PCR扩增小鼠Sod2启动子序列（-1554～+48）;构建由Sod2启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-Sod2p,测序鉴定其构建正确后将该载体瞬时转染小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）及小鼠肝癌细胞株Hepa 1-6,荧光/活细胞成像显微镜下观察静息或NaAsO₂、LPS刺激下红色荧光蛋白表达,以检测此段Sod2启动子的活性。结果证实,此段启动子在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后其转录活性增强。该段启动子成功克隆为下一步研究Sod2基因转录调控提供了载体。（四）内毒素血症小鼠Sod2启动子结合差异蛋白的筛选利用末端生物素（biotin）标记的Sod2启动子引物,PCR扩增Sod2启动子探针（biotin-Sod2p）。BALB/c小鼠以20 mg/kg腹腔注射LPS后2 h,提取肝脏组织核蛋白。将肝脏组织核蛋白与biotin-Sod2p探针结合,再用标记有链霉亲和素（streptavidin）的磁珠分离biotin-Sod2p-蛋白反应复合物,最后用DIGE样品裂解缓冲液洗脱磁珠上结合的蛋白。将此Sod2启动子结合蛋白洗脱液进行荧光差异双向凝胶电泳（2-D difference gel electrophoresis,2-D DIGE）。经过DeCyder软件分析,找到29个差异蛋白点,其中上调的22个,下调为7个。（五）内毒素血症小鼠Sod2启动子结合差异蛋白的质谱鉴定质谱鉴定前,对差异蛋白样品进行胰酶消化等多步处理后,将样品靶输入ABI 4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪中,获取肽质量指纹图谱（Peptide MassFingerprinting,PMF）,采用MS和MS/MS联合模式搜索SWISS-PROT数据库,质谱鉴定出来24个蛋白质。查阅文献对质谱鉴定出的蛋白的基本功能进行分析,已经有文献报导参与基因转录调节过程的蛋白有13个分别是:富含脯氨酸、谷氨酰胺的剪切因子（splicing factor,proline-and glutamine-rich,SFPQ）,含非POU域八聚体结合蛋白（non-POU domain-containing octamer-binding protein,NONO）,S100钙结合蛋白A8（S100 calcium-binding protein A8,S100A8）,S100钙结合蛋白A9（S100 calcium-binding protein A9,S100A9）,组蛋白H4,组蛋白H2B,核不均一核糖核蛋白L、A2/B1、H2,核内小分子核糖核蛋白F,前mRNA处理因子19,RuvB样蛋白Ⅰ（RuvB-like 1）,4-α-嘌呤甲醇胺脱水酶。（六）差异蛋白质的生物信息学分析利用WoLF PSORT蛋白定位预测软件及参考NCBI及Swiss-Prot数据库关于蛋白亚细胞定位信息对差异蛋白亚细胞定位进行综合分析。结果如下:完全定位于细胞核的蛋白有11个;既可定位于细胞核内,又可定位于其它多个亚细胞结构的有4个,在其它亚细胞结构定位,但不定位于细胞核内的有9个。以上结果表明,本实验所筛选的差异蛋白大多数都有核定位,这些生理或病理条件下能定位于细胞核的蛋白更可能参与Sod2的转录调控。运用String软件对鉴定的差异蛋白进行一级相互作用预测,结果发现S100A8与S100A9,NONO与SFPQ 2对差异蛋白之间存在相互作用,而且LPS刺激2 h后,S100A8与S100A9,NONO与SFPQ同Sod2启动子结合均同时上调,提示此两对蛋白可能以蛋白复合体的形式参与LPS诱导的Sod2基因转录调节。（七）细胞免疫荧光检测SFPQ、NONO、S100A8、S100A9细胞内定位为了明确SFPQ、NONO、S100A8和S100A9蛋白的细胞内定位及LPS刺激对其定位的影响,首先构建带有HA标签的SFPQ、NONO的真核表达载体pcDNA3-NONO-HA与pcDNA3-SFPQ-HA。分别将pcDNA₃-S100A8-HA、pcDNA₃-S100A9-HA、pcDNA₃-NONO-HA、pcDNA₃-SFPQ-HA转染至Hepa1-6细胞,进行细胞免疫荧光检测。结果显示,静息状态下,S100A8、s100A9在细胞浆和细胞核都有分布;LPS刺激细胞2 h后,S100A8移位入核,而S100A9在细胞内分布无明显变化。这种蛋白的差异分布提示两者在LPS诱导的基因表达中功能不同,S100A8可能参与了LPS诱导的Sod2基因表达调控。无论静息状态还是LPS刺激后,SFPQ、NONO都分布于细胞核内。（八）荧光素酶报告基因技术检测SFPQ、NONO、S100A8、S100A9过表达对Sod2基因转录表达的影响首先,构建Sod2启动子驱动的荧光素酶报告基因载体pGL3-Sod2p。测序鉴定质粒构建正确后,将pGL3-Sod2p与pSV-β-Gal共转染至Hepa 1-6细胞,检测细胞相对荧光素酶活性。静息状态下,pGL3-Sod2p转染组与转染pGL3-Basic阴性对照组相比相对荧光素酶活性明显增高（t=19.484,P＜0.01）。与转染pGL3-Sod2p的正常组相比,LPS刺激的pGL3-Sod2p转染组细胞的相对荧光素酶活性明显增高（t=5.561,P＜0.01）。以上结果说明,pGL3-Sod2p荧光素酶报告基因质粒在细胞内具有转录活性,且对LPS刺激具有很好的反应性,可用于后续的实验研究。为了检测NONO、SFPQ、S100A8、S100A9是否对Sod2基因转录具有调节作用,将SFPQ、NONO、S100A8和S100A9的真核表达载体单独或共同转染至Hepa 1-6细胞,检测各组相对荧光素酶活性。结果显示,静息状态下,各转染组间相对荧光素酶活性没有明显差别（F=0.876,P＞0.05）,说明静息状态下,NONO、SFPQ、S100A9、S100A8过表达对Sod2基因表达没有明显影响。而LPS刺激后,各转染组间相对荧光素酶活性有明显差别（F=34.361,P＜0.01）,pcDNA3-S100A8-HA转染组,pcDNA3-NONO-HA、pcDNA3-SFPQ-HA共转染组与转染pcDNA3-HA对照组相比相对荧光素酶活性明显增加（P＜0.01）,说明S100A8过表达或NONO、SFPQ共同过表达可增强LPS诱导的Sod2基因表达。通过以上研究,我们得出以下结论:1.本实验所克隆的Sod2启动子（-1554～+48）具有启动Sod2基因转录活性,炎性或氧化刺激能增强其活性。2.从活体肝组织胞核蛋白提取物中筛选并且质谱鉴定出24个可能参与LPS诱导的Sod2基因转录调控的蛋白,其中包括S100A8、S100A9、NONO、SFPQ等。3.静息状态下,S100A8、S100A9在细胞浆和细胞核都有分布;LPS刺激后,S100A8移位入核。无论静息还是LPS刺激后,SFPQ、NONO都分布于细胞核。4.S100A8过表达或NONO、SFPQ共同过表达可增强LPS诱导的Sod2基因表达。本研究基于DNA—蛋白质相互作用的原理,利用生物素—链霉亲和素系统在活体组织进行Sod2启动子结合蛋白的筛选,为从“转录调控组学”的角度研究基因转录调控过程及机制开创了新的思路。同时,本实验将生物素—链霉亲和素系统、磁珠分离技术与DIGE及质谱技术相结合,实现了转录调控研究技术和最新的差异蛋白质组研究技术的对接,为成功、高效地筛选和鉴定DNA结合蛋白提供了新途径。本实验所筛选和鉴定出的内毒素血症小鼠Sod2启动子结合差异蛋白,对于我们深入理解LPS诱导Sod2基因表达调控机制具有重要意义,同时也将为临床内毒素血症的治疗提供新的理论依据。