真核翻译起始因子eIF-5A的结构与功能研究以及酿酒酵母碳酸酐酶活性中心的结构研究

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(Ⅰ)真核翻译起始因子eIF-5A广泛的存在于真核生物和古细菌中,它是目前自然界中唯一一种含有特殊氨基酸hypusine的蛋白质。eIF-5A只有通过Hypusine化修饰后才能行使其功能。eIF-5A的鉴定最早源于未成熟的血红细胞中被纯化出来的蛋白。与经典的转录起始因子不同的是,eIF-5A并非所有蛋白质翻译所必需的因子。其功能众说纷纭,有研究发现eIF-5A很可能参与了mRNA跨核膜转运过程;而最近的研究又发现,酵母eIF-5A具有促进翻译延伸的作用,可能是一种翻译延伸因子;此外,酵母eIF-5A上的hypusine还被认为介导了蛋白质与RNA的序列特异性结合。为了更好地理解这些看起来有些争议的功能,多个不同物种的eIF-5A结构相继被解析。结果显示,这些同源蛋白的整体结构都包括两个结构域,并且均属于核酸结合结构域。在拟南芥中,eIF-5A包括三个亚型,即AteIF-5k1、A2和A3。其中研究得比较透彻的是AteIF-5A2亚型,它通过控制细胞的增殖与衰老在拟南芥的生长与发育过程中发挥着重要的作用。我们表达纯化了拟南芥AteIF-5A2蛋白,收到了2.3 A的晶体衍射数据,并解析了AteIF-5A2的结构。每个非对称单位包含两个AteIF-5A2亚基,每个亚基包括两个结构域,结构域之间依靠一段柔性的loop区彼此相连。与之前报道的同源结构不同,拟南芥AteIF-5A2结构中的两个分子以轴对称的方式平行排列,在Hypusine化位点的周围形成较大面积的带正电的沟,从而更有利于核酸的特异结合。此外,在AteIF-5A2的N端结构域中,参与形成同二聚体的氨基酸残基在植物中高度保守。因此我们推测这种以轴对称方式平行排列的二聚体形式是植物eIF-5A特有的聚合形式。eIF-5A的Hypusine化修饰是一种翻译后修饰,它需要通过两次反应来完成,分别是Deoxyhypusine合成酶(DHS, EC 1.1.1.249)和Deoxyhypusine羟化酶(DOHH,EC 1.14.99.29)。DHS催化第一步反应,通过NAD依赖的转移反应将亚精胺的氨基丁烷部分转移给eIF-5A上的赖氨酸,将其转化为脱氧hypusine (Ns-(4-aminobutyl) lysine)。为了研究DHS的催化机制,人们解析了人源DHS四种状态下的晶体结构,结果显示,DHS以四聚体的形式存在,底物结合位点位于两个亚基之间的相互作用界面上,其N端motif对DHS的活性起到“门控”的作用。我们解析了酿酒酵母中DHS (Dysl)的2.8A分辨率的结构。与其同源结构类似,一个非对称单位包含两个Dysl蛋白分子,这两个分子可以和另一非对称单位中的两个分子形成稳定的四聚体。每一个Dysl亚基结合了一个NAD分子。通过我们解析的Dysl蛋白结构和已被解析的Hyp2的晶体结构(PDB code: 3er0),我们利用HADDOCK程序搭建了两者复合物的模型,并初步探讨了其相互作用界面,为下一步的研究提供了结构依据。(Ⅱ)碳酸酐酶(CK,EC 4.2.1,1.)是一种结合锌离子的金属酶。它可以可逆催化二氧化碳和水生成碳酸氢根和氢离子的反应,在光合作用、呼吸作用、体内pH值调节和离子传递等方面发挥着重要作用。碳酸酐酶是一类以功能来命名的酶类,依据其结构的不同,又可细分为六大类,分别是:α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-CAs。其中β-CA存在于高等植物、藻类和一些原核生物中。酿酒酵母的β-CA被称为Ncel03/YNL036W.我们解析了Nce103和其底物类似物的2.04 A分辨率的晶体结构。Nce103以二聚体形式存在,活性位点位于两各单体的作用界面上。在活性位点的底部,一个锌离子与Cys57,His112,Cys115和一个水分子配位结合。保守的氨基酸残基Asp59、Arg61、Gly111、Leu102、Va180、Phe75和Phe97形成了Nce103的活性通道。在活性通道中结合了一个底物类似物乙酸分子。Nce103的整体结构和典型的植物类β-CA的结构类似。通过结构比对以及计算,我们绘制了底物/产物进出活性通道的模型,活性中心正位于这个漏斗形活性通道的底部。此外,我们还通过酶活实验证明Nce103的N端手臂区对酶活很重要,而N端不保守的延伸区域则对酶活没有影响。
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