【摘 要】
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神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种能促进神经元细胞增殖和分化的蛋白。提取自小鼠唾液腺的鼠源神经生长因子(mouse NGF,m NGF)在我国已被批准作为药物用于治疗人神经退化及损伤类疾病。m NGF虽然与人神经生长因子(human NGF,h NGF)同源性很高,但它在人细胞中的生物活性显著低于h NGF,且其作为药物用于人类临床治疗仍然存在免疫原性问题。因此,
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神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种能促进神经元细胞增殖和分化的蛋白。提取自小鼠唾液腺的鼠源神经生长因子(mouse NGF,m NGF)在我国已被批准作为药物用于治疗人神经退化及损伤类疾病。m NGF虽然与人神经生长因子(human NGF,h NGF)同源性很高,但它在人细胞中的生物活性显著低于h NGF,且其作为药物用于人类临床治疗仍然存在免疫原性问题。因此,如能高效低成本生产高活性的h NGF,将可用其来替代目前使用的m NGF药物。动物唾液腺天然高水平表达高活性的NGF,这表明动物唾液腺是NGF表达的一个理想组织。此外,动物唾液腺也是一种潜在的高效的生物反应器。本研究的目的是利用转基因猪唾液腺作生物反应器生产h NGF。本研究将携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)筛选标记基因的h NGF表达载体转染猪胎儿成纤维细胞,筛选获得转h NGF基因单细胞克隆团,将其作为供体细胞通过体细胞克隆法制备出4头原代转h NGF基因猪;EGFP表达观察,PCR和Southern blot分析都证明该4头原代转基因猪基因组整合了外源的EGFP和h NGF基因;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测结果显示转基因猪唾液中分泌的h NGF浓度约达600-1200ng/m L;用含高浓度h NGF的转基因猪唾液处理培养的PC12细胞证明其具有促进类神经元细胞分化的活性;为了防止转基因猪表达的内源猪神经生长因子(pig NGF,p NGF)“污染”从唾液中纯化的h NGF,本研究还构建了11个靶向猪神经生长因子(p NGF)基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,选出两个突变p NGF基因效率最高的载体,将其共转染从转h NGF基因猪耳组织分离培养的的成纤维细胞后,成功筛选得到5个p NGF基因被敲除的转h NGF基因单细胞克隆团。该5个单细胞克隆团在后续研究中可作为供体细胞用体细胞克隆法制备p NGF基因敲除的转h NGF基因猪。综上,本研究成功建立了一种利用转基因猪唾液腺作为生物反应器制备人类药物蛋白的新技术,并为制备h NGF蛋白提供了一种高效的新方法。
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