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研究背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)性心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)已成为威胁人类健康的主要病因之一,但其发病机制目前尚未完全阐明,亦缺乏高灵敏性和特异性分子标志物。As是CVD最主要的病理基础,脂代谢异常是其重要的危险因素,其中氧化脂蛋白(ox-LDL)起着关键作用。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度约为19-22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,在转录后水平调控基因表达,并在氧化脂蛋白诱导As相关细胞中发挥重要作用,参与脂代谢异常As性CVD的发生、发展。新近研究显示,人外周血循环中也存在丰富、稳定表达的miRNA,且部分具备生理功能的循环miRNA可由不同类型细胞分泌的外泌体(exosome)包裹(称为分泌型miRNA),并运送至受体细胞进行细胞间的信息交流,参与包括As性CVD在内的多种疾病的病理过程。因此,探寻As性疾病中的关键分泌miRNA及其作用机制,将对疾病的早期诊断提供新的更加敏感、特异的标志物,为开发出新的治疗方法奠定理论基础。目的:(1)筛选巨噬细胞和ox-LDL刺激诱导的泡沫细胞模型中表达显著变化的miRNA,分析其在细胞及其培液中存在形式及变化趋势;(2)探讨As患者血清、exosome及exosome free血清中该miRNA是否发生相应水平改变,以期为As患者的诊断和治疗提供新思路与新方法;(3)探寻特异变化分泌miRNA在As过程中的作用机制。方法:(1)首先将佛波醇-12-肉豆蔻-13-乙酯(PMA)加入到THP-1中,诱导成为巨噬细胞,泡沫细胞的诱导是在巨噬细胞诱导成功的基础上加100μg/ml ox-LDL,刺激48 h,通过油红O染色鉴定泡沫细胞模型是否构建成功。将构建成功的巨噬细胞和泡沫细胞模型通过Affymetrix miRNA芯片筛选出细胞内异常表达的miRNA,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(quantitative Real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证巨噬细胞与泡沫细胞内miRNA的变化。用试剂盒提细胞培液中的exosome,进一步检测特定变化miRNA在巨噬细胞与泡沫细胞分泌的exosome中的表达。(2)收集30例急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者血清标本,并选择同期体检健康者30例为正常对照组,利用qRT-PCR技术验证前期筛选出的特异变化的miRNA在血清中总miRNA、exosome和exosome free血清中表达水平的变化。ROC曲线分析该miRNA作为疾病标志物的敏感性和特异性。(3)通过生物信息学软件预测特定变化分泌miRNA与As相关细胞功能联系紧密的靶蛋白。Dil染料标记exosome,与As相关细胞共培养,通过激光扫描共聚焦显微镜证实exosome是否进入细胞内,并检测该细胞内表达变化的miRNA水平。通过凋亡实验、Western Blot和qRT-PCR技术研究miRNA对As相关细胞功能的影响。通过荧光素酶报告基因实验及过表达或抑制表达特定变化分泌miRNA实验验证其与靶蛋白的关系。结果:(1)芯片结果表明,与巨噬细胞相比,泡沫细胞内发生水平改变的miRNA为 miR-99,miR-139,miR-1973 和 miR-6757,均表达上调。qRT-PCR 验证结果表明,与巨噬细胞相比,泡沫细胞内miR-99(P=0.0177)和miR-139(P=0.0240)水平均显著性升高,miR-1973和miR-6757未出现显著性差异(P>0.05)。与巨噬细胞相比,泡沫细胞分泌的exosome中miR-139水平显著性升高(P=0.0216)。(2)与正常对照组相比,AMI患者血清中总miR-99(P=0.0406)、exosome中miR-99(P=0.0049)和 exosome free 血清中 miR-99(P=0.047)均显著升高,总 miR-139 显著性升高(P=0.0051),而 exosome 和 exosome free 血清中 miR-139因含量低而不能稳定检测。ROC曲线结果显示,miR-99和miR-139鉴别AMI患者的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.631(95%CI 0.489～0.773)和0.650(95%CI 0.511～0.789),敏感度均为67%。(3)生物信息学软件预测胰岛素样生长因子 1 受体(insulin-like growth factor 1,IGF-1R)可能是 miR-139 的靶基因。激光扫描共聚焦显微镜证实exosome成功进入HUVEC内,将泡沫细胞分泌的exosome与HUVEC共培养,可以显著性的升高HUVEC中miR-139的水平(P=0.0153);功能实验发现,相对于巨噬细胞组,泡沫细胞分泌含miR-139丰富的exosome与HUVEC共培养后,HUVEC的凋亡率显著增加两倍。荧光素酶报告基因实验结果显示:过表达或者抑制miR-139,荧光素酶活性相应降低至1/3(P<0.001),或者升高2倍(P<0.05);种子序列突变后,实验组与对照组的荧光素酶活性无显著性差别,最终证明miR-139可与IGF-1R mRNA的3’-UTR结合。结论:ox-LDL引起泡沫细胞内miR-99和miR-139水平增高,且分泌型miR-139可以作为细胞间的交流分子负向调控HUVEC内的靶蛋白IGF-1R,降低其表达并促进HUVEC的凋亡。本实验提示,miR-139可能是促进As发生与发展的重要分子,同时也为As的诊断及治疗提供了新思路。