食品中的细菌既有可以引起疾病的致病菌,也有对食品生产和人体健康有益的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)。食源性致病菌是影响食品安全的关键因素之一,因此,食源性致病菌的快速检测对确保食品安全至关重要。传统的食源性致病菌检测方法往往耗时较长。表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术具有操作简单,灵敏度高,以及可以实现无损检测的特点,该技术在微生物检测中的应用日渐广泛。本课题利用SERS技术结合成像技术和化学计量学方法,建立了食源性致病菌快速检测和鉴定的方法。LAB可以改善食品的风味,提高食品的保藏性和营养价值,其在食品生产中应用广泛。而具有抗生素抗性的LAB可能会在人体的胃肠道内将其抗性基因传递给致病菌,因此,在食品中使用这类LAB可能存在一定的安全隐患。快速识别具有抗生素抗性的LAB有助于确保其用于食品生产的安全性。本课题研究了LAB在葡萄酒发酵中的应用,并利用SERS技术建立了快速鉴别其抗生素敏感性的方法。本论文的研究内容和试验结果主要有以下五个方面:(1)以银枝晶为增强基底建立一种可以快速检测和鉴定Salmonella enterica和Escherichia coli的无标记SERS成像方法。试验中优化了影响细菌SERS光谱的参数,通过参数优化提高了细菌的SERS光谱的强度,利用成像技术采集了位于银枝晶表面的细菌的SERS光谱,并利用细菌独特的光谱信息建立了其鉴定模型。本试验中所建立的SERS成像方法对于Salmonella enterica subsp enterica BAA1045(SE1045)的最低检出限(limit of detection,LOD)为104 CFU/m L,比相同试验条件下常规SERS方法的LOD低了两个数量级。试验中采集一幅包含225个样品点的SERS图像所需的时间为24 min。结合PCA,SERS成像法可以实现SE1045和Escherichia coli BL21混合样品的快速检测和鉴定。(2)以4-巯基苯硼酸(4-mercaptophenylboronic acid,4-MPBA)修饰的银枝晶为基底,建立一种可以富集、检测和鉴定牛奶中细菌的SERS成像方法。通过4-MPBA修饰可以提高银枝晶对细菌的捕获能力,使其可以选择性的增强细菌的SERS信号。试验中选择了Salmonella作为食源性致病菌的代表来优化所建立的SERS成像方法并验证该方法的可行性。经4-MPBA修饰的银枝晶基底对浓度为106 CFU/m L和103 CFU/m L的SE1045的捕获效率分别为84.92±3.25%和99.65±3.58%。以4-MPBA修饰的银枝晶为基底采集的四株不同细菌的SERS光谱具有明显的差异,可以用于鉴别不同的细菌。利用成像技术可以在30 min内采集一幅包含400条光谱的SERS图像(面积60μm×60μm)。该方法在50 m M NH4HCO3溶液中对SE1045的LOD为103 CFU/m L,在1%的酪蛋白溶液和脱脂牛奶中对SE1045的LOD均为102 CFU/m L。该研究结果表明,基于4-MPBA修饰的银枝晶的SERS成像方法可以用于液态食品中致病菌的快速检测。(3)研究了Oenococcus oeni(O.oeni)在葡萄酒苹果酸乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)中的应用,并对其关键酶,苹果酸乳酸酶(malolactic enzyme,MLE)进行分离、纯化和特性研究。试验中考察了23株O.oeni的MLF性能。通过在模拟酒培养基和刚完成酒精发酵的酒中进行小批量MLF试验,筛选出了两株对L-苹果酸的降解能力优于商品化的发酵剂O.oeni 31MBR的新菌株,O.oeni CS-4b和O.oeni ME-5b。并从具有良好MLF性能的O.oeni SD-2a中,分离纯化出了活性较高的MLE。使用MLE降解L-苹果酸,具有高效且不受基质中营养条件限制的优点。试验中通过硫酸鱼精蛋白沉淀,离子柱交换层析和凝胶过滤层析,MLE的纯度提高了43倍。纯化后MLE的活力为419.2 U/mg,产量为0.42%。O.oeni SD-2a中MLE的理论分子量为59 k Da,理论等电点为4.76。MLE的最适反应温度为35°C,最适反应p H为6.0,在30°C和p H 6.0时,对L-苹果酸的Km和Vmax分别为12.51×10-3 M和43.86μmol/(min×mg)。(4)研究了抗生素处理对Lactococcus lactis(L.lactis)的生化组分的影响。试验中以柠檬酸修饰的50 nm的金纳米颗粒(Au NPs)为SERS增强基底,采集了经抗生素处理的L.lactis的SERS光谱。SERS光谱的PCA结果表明,经抗生素处理30 min的L.lactis的SERS光谱与对照组(未经抗生素处理)无明显的差异,而经抗生素处理60和90 min的L.lactis的SERS光谱与对照组有明显的差异。此外,不同抗生素处理诱导的细菌的SERS光谱的变化明显不同。通过光谱比对,可以将SERS光谱的变化转换为细菌在经受抗生素处理时生化组分的变化。因此,SERS方法不仅可以检测到细菌的生化组分的变化,而且可以反映发生变化的物质的具体信息,可以帮助我们更好的理解LAB对抗生素处理的反应,为鉴定其抗生素敏感性奠定基础。(5)利用SERS技术快速鉴定LAB对作用于其细胞壁的抗生素的敏感性。试验中选择了Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus(Lb.bulgaricus)ATCC11842作为食品中常用LAB的代表,使用不同浓度的青霉素G,氨苄青霉素和万古霉素分别处理Lb.bulgaricus ATCC11842 30,60和90 min。试验中,以柠檬酸修饰的50 nm金溶胶纳米颗粒作为SERS增强基底,采集了Lb.bulgaricus ATCC11842的SERS光谱,并使用PCA和偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)对其光谱进行分析。PCA结果表明,Lb.bulgaricus ATCC11842的SERS光谱的变化与抗生素的浓度和处理时间有关,不同抗生素处理诱导的Lb.bulgaricus ATCC11842的SERS光谱的变化明显不同。PLSR分析结果表明,Lb.bulgaricus ATCC11842的SERS光谱与其增殖能力之间具有良好的相关性。本研究所建立的SERS方法用时较短,测定全过程仅需不到3 h,可以快速鉴别并量化细菌对抗生素处理的敏感性。