酪蛋白占牛乳蛋白质总质量的80%,是人体重要的营养来源,并表现出一定的生理调节作用。研究表明,在体外对酪蛋白进行酶水解后能产生一系列有活性的肽段如抗氧化肽、ACE抑制肽、阿片肽等,但酪蛋白在生理环境内被消化是否能产生类似的具有生理活性肽段,以及这些肽段在体内是否能被完整吸收并发挥相应的生理作用还有待研究。本研究对牛乳酪蛋白进行体外模拟胃肠消化水解,分析水解物的水解度及抗氧化和抗菌活性,并通过SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、CE、 RP-HPLC检测水解物中多肽分子分布状态,再辅以动物胃肠消化酪蛋白验证其消化降解情况。建立Caco-2细胞的培养体系以评价其对肠细胞生长的影响,并采用Transwell板单层膜细胞吸收模型进行酪蛋白水解物的过膜吸收,以确定可被吸收的多肽特征。主要结果如下：(1)体外模拟胃肠消化水解研究。随着酪蛋白水解时间变长,水解物中游离氨基的含量和水解度逐渐增加,增加的速率下降。游离氨基含量变化表明,胃肠联合水解程度>肠水解>胃水解。胃水解5h时,水解度为12.9%,胃肠联合水解,水解度最终达到72%左右。酪蛋白水解液的DPPH自由基清除率,1 h时为29.2%,2 h时达到最大值46.4%,2h后逐渐降低,5h时降至34.4%。酪蛋白水解液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有抑制作用,且对前者的抑制效果明显强于后者,抑菌圈直径分别为36.7 mm和19.5 mm,其中水解2h时,水解液抑菌效果最好。(2)通过SDS-PAGE分析发现,经过模拟胃液5h的水解,溶液中主要分子量分布由24～26 kDa降到17 kDa以下。通过Tricine-SDS-PAGE分析发现,再经过肠液5h的水解,溶液中分子量主要分布于7 kDa左右,分子量3.5kDa条带清晰可见。CE、RP-HPLC分析结果均出现单一峰,峰形良好并无拖尾现象。不同水解时间的CE分析表明,酪蛋白被逐步分解为小分子肽和游离氨基酸。RP-HPLC分析结果则显示了水解物中肽段随水解进行,亲疏水性发生了改变,并表明强疏水或亲水的肽段能被优先消化水解,亲水性的多肽增加,而小分子亲水性的多肽能够保持更多肽链不受肠消化的破坏。通过体内体外消化水解物的CE和RP-HPLC分析对比,证明模拟体外胃肠水解的方法无论从保留时间、分子大小还是亲疏水性上,都有着一定的相似性,计算机辅助相似性评价系统选定标志性差异峰形和普通峰性自动匹配,分析其相似度都在80%以上,本研究所模拟的胃肠环境可以达到实验要求。(3)建立Caco-2细胞单层膜模型。当以细胞密度1×105 cells/mL接种25cm2细胞培养瓶,细胞传代周期为4-5天,传代比为1：3,消化4min,此时细胞成团状分布但贴壁繁殖速率较快。通过21d的培养,显微镜观察Transwell板上Caco-2细胞单层膜生成状态,与空白图对比,细胞膜致密,无明显断裂。TEER测定结果可知,21d时的TEER值为1579 Ω·cm2,已经超过最低限度500Ω·cm2。检测标志物荧光黄过膜量,通过荧光黄强度标准曲线和Papp公式计算,得到该膜的Papp值为0.27×10-6cm/S,小于0.5×10-6cm/s,且平均透过率为0.37%。三个通透性指标均达到过膜实验要求,所建Caco-2单层膜致密、完整。(4)水解物的Caco-2细胞膜吸收。通过检测CE及RP-HPLC检测细胞膜顶侧和基底侧多肽谱图来完成。CE结果显示,14min前6 kDa以下的小分子多肽,能被成功吸收进入单细胞层下侧,小分子的多肽、氨基酸等更容易被快速吸收。RP-HPLC结果显示,亲或疏水性的多肽都能被吸收进入单细胞层下侧,但疏水性多肽不易通过,易被降解或阻止。本研究对牛乳酪蛋白的体内及体外水解特征做了初步探索,并建立了检测分析多肽的四种方法,采用Caco-2细胞单层膜对水解多肽的吸收特点进行了初探,为阐明酪蛋白在肠道内吸收机制的深入研究奠定了基础。