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神经胶质瘤来源于神经胶质细胞,起源自神经外胚层,是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,具有发病率高、复发率高、病死率高的特点。其不可控的增殖以及对化疗药物不敏感是胶质瘤病情进展快、生存期短及难以根治的主要原因,目前对胶质瘤的治疗仍以手术及术后放化疗为主,而目前的治疗方案并不能显著抑制肿瘤的复发、改善患者的预后、延长生存期。肿瘤的增殖和耐药多由于抑癌基因的失活及癌基因的异常激活导致,因此更加全面的了解肿瘤细胞增殖及耐药的分子机制可以为后期的分子靶向治疗提供有效的理论支持。卵泡抑素类似蛋白1（Follistatin-like protein 1,Fstl1）是一类分泌性蛋白,最初在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中发现,因其蛋白结构类似卵泡抑素蛋白（Follistatin）,所以被称为卵泡抑素类似蛋白（follistatin-related polypeptide,FRP）。Fstl1蛋白属于富含半胱氨酸的酸性蛋白家族（secreted protein,acidic,rich in cysteine family,SPARC family）,其蛋白结构包含钙离子结合结构域、血管假性血友病因子C型结构域、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域和卵泡抑素样结构域。Hambrock等人的研究发现Fstl1虽然具有能结合钙离子的EF-hand,但是Fstl1并不能同钙离子相结合,这说明虽然Fstl1属于SPARC家族,但是其具有一些独特的特性。Sundaram GM等人的研究表明Fstl1的3’UTR端的一个外显子区含有 miR-198 前体,即 Fstl1 可作为 miR-198 前体在 KSRP（The KH-type splicing regulatory protein,also known as KHSRP）的调节下衍生出 miR-198。众多研究显示Fstl1在卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌以及胰腺癌等多种肿瘤发挥促癌或抑癌的作用。既往研究发现胶质瘤组织中Fstl1的表达量显著高于非肿瘤脑组织,且高表达Fstl1的患者预后较差,上述研究提示在胶质瘤中Fstl1可能扮演促癌基因的角色,但是Fstl1在胶质瘤生物学功能中的作用及机制仍不清楚。在本课题的第一部分中,我们首先借助中国胶质瘤协作组（Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA）以及 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库,分析 Fstl 1在胶质瘤组织和非肿瘤脑组织中的表达情况,同时关注Fstl1与患者生存预后的关系。随后,使用shRNA（short hairpin RNA）干扰手段和Fstl1过表达质粒分别下调和上调胶质瘤细胞中的Fstl1,通过CCK-8及平板克隆实验检测Fstl1对胶质瘤细胞增殖的影响,同时通过流式细胞术评价Fstl1对胶质瘤细胞凋亡的影响。结果显示:Fstl1下调后,胶质瘤细胞的增殖能力减弱,细胞凋亡率增加,胶质瘤细胞对TMZ（temozolomide）的敏感性增强。而过表达Fstl1可显著促进胶质瘤细胞的增殖,抑制细胞凋亡,增加肿瘤细胞对TMZ的耐药性。接下来我们应用裸鼠进行胶质瘤颅内原位模型的建立,体内实验研究发现过表达Fstl1可促进胶质瘤细胞增殖及对TMZ的耐药性,而下调Fstl1可抑制胶质瘤的增殖并增加肿瘤细胞对TMZ的敏感性。这说明Fstl1在胶质瘤细胞增殖、凋亡及TMZ耐药中发挥重要作用。C-fos（Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit,c-fos or FOS）基因是肿瘤发生演进过程中的经典癌基因之一,其在多种肿瘤中高表达,且与胶质瘤的增殖、耐药密切相关。Tanaka等人的研究表明过表达Fstl1可显著抑制c-fos的表达,而Kim等人的研究发现在破骨细胞中过表达Fstl1可促进c-fos的表达。为了验证在胶质瘤中Fstl1同c-fos的关系,我们分别在不同的胶质瘤细胞系中下调和上调Fstl1,过表达Fstl1可显著促进c-fos的表达,而下调Fstl1可抑制c-fos的表达。蛋白质免疫共沉淀发现Fslt1可以特异性的同DIP2A（disco interacting protein 2 homolog A）结合,过表达 DIP2A 可显著逆转 Fstl1对c-fos表达的促进作用,而敲除DIP2A可阻断Fstl1对c-fos表达的影响。DIP2A是 DIP2 家族（the disconnected（disco）-interacting protein 2 family）—员,其蛋白结构包含DMAP,CaiC和AMP结合结构域。免疫共沉淀发现DIP2A可以通过同DMAP1（DNA methyltransferase 1 associated protein 1）结合参与到DMAP1-HDAC2转录抑制复合体中,促进HDAC2（histone deacetylase 2）转录抑制复合体对c-fos上游启动子区组蛋白的去乙酰化,进而抑制c-fos的转录,而过表达Fstl1可竞争性结合DIP2A,将DIP2A限制在细胞质中,进而阻碍DIP2A同HDAC2转录抑制复合体的结合,最终削弱HDAC2转录抑制复合体对c-fos转录的抑制作用,促进c-fos的转录。因此Fstl1通过DIP2A/HDAC2/c-fos信号通路参与调节胶质瘤细胞的增殖及耐药。微小RNA（microRNAs,miRNA）近10年来始终是肿瘤研究领域的热点。miRNA的信号传递体系包括多种形式,miRNA可通过碱基配对识别特异性的mRNA,即 miRNA 可以同 mRNA 的 3’端非编码区域（3’-untranslated region,3’-UTR）相结合,3’-UTR结合了 miRNA的mRNA的稳定性变差,更易为RNA降解酶识别降解,另一方面miRNA同mRNA 3’-UTR结合后可以抑制mRNA的翻译,进而阻碍mRNA的表达。随着基础生物学研究的深入,miRNA的功能不仅局限于3’-UTR,其还可以联合LncRNA等多种小分子RNA发挥生物学功能。既往大量研究表明肿瘤的发生发展多伴有miRNA的异常表达,miRNA与肿瘤的增殖、侵袭、迁移、耐药及预后密切相关,是调控肿瘤的重要分子。在本课题第二部分中,我们首先借助CGGA数据库,分析miR-198在胶质瘤组织和非肿瘤脑组织中的表达情况,同时关注miR-198与患者生存预后的关系。结合生物信息学靶点预测,我们发现O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（06-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）的 3’-UTR 有一个 miR-198的结合位点,因此我们构建了 MGMT 3’UTR区与miR-198潜在结合位点的荧光素酶报告基因质粒,报告基因检测验证MGMT确实为miR-198的直接靶基因。MGMT是胶质母细胞瘤抗TMZ的主要机制,MGMT是一种DNA损伤修复酶,其可迅速去除TMZ附着在鸟嘌呤残基O6位置的甲基,因此抵消TMZ的抗肿瘤作用。进一步研究发现过表达miR-198可显著促进胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,而同时过表达MGMT可逆转miR-198对胶质瘤耐药性的影响。体内外实验均证明miR-198通过下调MGMT提高胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。成熟的mRNA Fstl1一方面可以进入细胞质中编码蛋白,另一方面可以同KSRP结合衍生出miR-198,那么是什么调控mRNA Fstl1的去向呢?在本课题第三部分中,我们研究发现lncRNA H19可以特异性同KSRP结合,进而阻碍KSRP如何同Fstl1 3’-UTR结合。即在低表达H19的情况下,KSRP进入细胞核中同Fstl1 3’-UTR特异性位点结合,招募Drosha酶对Fstl1 3’UTR进行剪切生成pre-miR-198,最终在Dicer酶的作用下生成成熟的miR-198。而在高表达H19的情况下,KSRP特异性同H19结合并被限制在细胞质中,Fstl1则作为成熟mRNA进入核糖体中编码蛋白。因此H19通过KSRP调节细胞内Fstl1和miR-198的水平。