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T-2毒素是由镰刀菌等真菌所产生的次级代谢产物,属于霉菌毒素中的单端孢霉烯族A类化合物,其性质稳定,毒性强,广泛分布于自然界中频繁污染粮食作物。畜禽相较于人来说更容易接触霉菌,一旦摄入被污染的粮食作物可发生中毒甚至死亡等,给农业和畜牧业带来重大的经济损失。细胞色素P450氧化酶是一类代谢内源和外源化合物的主要酶系,参与人体75%以上的代谢活动,很多研究证实大部分CYP450酶的代谢物又是CYP450的诱导剂,可以转录调节CYP450的表达和活性。其中CYP1A亚族由于易被外源化合物显著诱导而受到人们的广泛关注。本实验室前期研究中发现,T-2毒素可以显著诱导鸡CYP1A家族转录水平的上升,并且CYP1A5参与T-2毒素的羟化代谢。而在鸡CYP1A家族中仅两种亚型,分别是CYP1A4和CYP1A5,但是目前对于T-2毒素调控鸡CYP1A家族表达的分子机制以及作用机理并不清楚,通过揭示T-2毒素诱导鸡CYP1A亚族表达的调控机制,在一定程度上不仅可以丰富禽类CYP1A家族响应单端孢霉烯族毒素的调控模式,同时也为后续霉菌毒素的防控工作提供理论基础。因此,为了进一步探讨CYP1A家族响应T-2毒素的代谢调控网络,本研究将从本底和诱导调控两个方面进行探究。在对CYP1A5本底调控机制的研究中,通过双荧光素酶实验发现CYP1A5启动子转录起始位点上游-311到-253之间存在芳香烃受体Ah R（aryl hydrocarbon receptor）结合的外源性代谢元件XRE（xenobiotic response element）,通过突变XRE元件关键位点以及凝胶阻滞实验（DNA mobility shift assay,EMSA）证实Ah R可以结合在-311到-253的XRE位点上。将Ah R的过表达载体和-311/-1的报告载体同时转染到COS-7细胞中,结果显示CYP1A5的启动子活性显著上调;敲降Ah R后发现CYP1A5的表达水平显著下降,上述结果表明Ah R通过结合在-311到-253的启动子区间转录激活CYP1A5的本底表达。T-2毒素诱导CYP1A5的表达中,前期实验发现Ah R的拮抗剂白藜芦醇可以抑制T-2毒素对CYP1A5转录水平的诱导,表明Ah R可能参与T-2毒素对CYP1A5的诱导。首先,我们用T-2毒素处理敲降Ah R的细胞发现,T-2毒素无法回复其对CYP1A5的诱导。之后利用核质分离的方法发现T-2毒素可以促进Ah R向核内富集。为了探究Ah R在CYP1A5启动子上的结合区域,我们用T-2毒素处理转染CYP1A5截短启动子报告载体的LMH细胞,发现在-311到-253区间启动子活性显著下降。进一步采用DAPA（DNA Affinity pull down assay）方法,发现T-2毒素可以促进Ah R结合在-311到-253的XRE位点上。上述结果表明T-2毒素通过促进Ah R向核内富集,从而诱导CYP1A5的表达。为了探究CYP1A5的高表达对细胞产生的效应机制,我们用T-2毒素处理过表达CYP1A5的细胞后,发现T-2毒素可以增加细胞的死亡率并伴随DNA损伤和细胞凋亡,但是单独过表达CYP1A5对细胞存活无影响,此结果表明CYP1A5可以增加T-2毒素的毒性作用。因此,本研究发现Ah R既参与CYP1A5的本底表达又参与T-2毒素的诱导过程,并且T-2毒素可以通过诱导CYP1A5的表达增加细胞毒性作用。前期研究中已经发现CYP1A4的本底启动子活性显著高于CYP1A5,但本底表达低于CYP1A5,我们猜想可能是由于两者存在表观遗传学修饰的差异。本研究首先对CYP1A4的启动子进行预测,发现CYP1A4的5’UTR区域存在4个Cp G岛,说明甲基化修饰可能参与CYP1A4的表达调控。接下来,我们通过体外模拟甲基化实验发现甲基化可以抑制CYP1A4的启动子活性,但对CYP1A5的启动子活性无影响;加入甲基化抑制剂可以上调CYP1A4转录水平。在T-2毒素诱导CYP1A4的转录水平中,发现T-2毒素诱导CYP1A4的转录水平显著高于CYP1A5,我们猜测鸡CYP1A家族在诱导中的差异是否也与DNA甲基化有关,为了探究甲基化修饰在诱导过程中的作用,通过采用不同时间的T-2毒素处理LMH细胞结合甲基化敏感限制性内切酶结合q PCR（methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitatire PCR,MSRE-q PCR）的方法,发现CYP1A4的Cp G3岛甲基化水平同CYP1A4的诱导转录水平的动态趋势趋于相反;其中在T-2毒素处理细胞12 h时,Cp G3岛的甲基化水平降到最低,而此时CYP1A4的转录水平最高。进一步通过对CYP1A4的启动子截短和突变发现Cp G3岛存在Ah R结合元件XRE,并且该元件附近的甲基化水平在T-2毒素处理后下降10%。Ch IP实验发现T-2毒素可以使位于XRE附近区间的DNA甲基转移酶Dnmt1的富集程度下降。综上,本研究发现CYP1A4的本底表达受到甲基化和Ah R的调控,并且T-2毒素对CYP1A4的诱导是通过Cp G3的去甲基化引起的。