【摘 要】
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本研究以MC3T3-E1细胞系为实验材料，通过转染CHIP基因、Western blot、细胞定向诱导分化、碱性磷酸酶活性测定、碱性磷酸酶染色、Von Kossa 染色、茜素红染色、荧光素酶报告基因实验和3H掺入实验，得到以下结果：1 首次建立了过表达CHIP的MC3T3-E1/HA-CHIP稳定细胞系。并通过Western blot检测证明2#和8#两个克隆细胞系稳定地表达HA-CHIP蛋白。
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本研究以MC3T3-E1细胞系为实验材料，通过转染CHIP基因、Western blot、细胞定向诱导分化、碱性磷酸酶活性测定、碱性磷酸酶染色、Von Kossa 染色、茜素红染色、荧光素酶报告基因实验和3H掺入实验，得到以下结果：1 首次建立了过表达CHIP的MC3T3-E1/HA-CHIP稳定细胞系。并通过Western blot检测证明2#和8#两个克隆细胞系稳定地表达HA-CHIP蛋白。建系过程中发现用LipofactamineTm 2000 转染试剂（Promega）转染效率较高，用 0.6—1.0mg/ml的G418选择培养有利于建单克隆细胞系。2 用10mM/ml甘油磷酸钠和50ug/ml的抗坏血酸条件培养基诱导野生型MC3T3-E1细胞系和过表达CHIP的MC3T3-E1/HA-CHIP稳定细胞系向成骨细胞方向定向分化，结果发现野生型MC3T3-E1细胞系在诱导至13天时AKP活性最高，是诱导7天时的11倍，诱导16天以后AKP活性逐渐下降； 而过表达CHIP的稳定细胞系在整个诱导培养过程中AKP活性变化不大；又通过AKP活性染色实验证实了AKP活性测定的结果。说明用10mM/ml甘油磷酸钠和50ug/ml的抗坏血酸条件培养基诱导两个细胞系向成骨细胞分化时，过表达CHIP蛋白抑制MC3T3-E1细胞分化。3 用条件培养基诱导两个细胞系定向分化至18天以后，用Von Kossa染色和茜素红染色方法检测到野生型MC3T3-E1细胞系中有较多的磷酸钙生成，并且在显微镜下可以看到有钙化结节产生；过表达CHIP的细胞系中只有很少的磷酸钙生成，在显微镜下可见有较少钙化结节产生。说明过表达CHIP蛋白抑制MC3T3-E1细胞矿化。4 利用荧光素酶报告基因试验发现过量表达CHIP后Smad3的转录活性显著下降。5 Western blot 检测野生型MC3T3-E1细胞系和过表达CHIP的MC3T3-E1/HA-CHIP稳定细胞系中Smad3蛋白水平，发现过量表达CHIP的稳定细胞系Smad3蛋白水平下降，提示CHIP可能降解了Smad3蛋白。6 3H掺入实验显示MC3T3-E1细胞系在过量表达CHIP时抑制MC3T3-E1细胞增殖。
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