目的:扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy,DCM)、肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)是原发性心肌病中最常见的两类,均属于遗传性心肌病范畴,具有明显的遗传学背景。目前研究已经发现超过30种基因与DCM相关,超过20种基因,1400余种突变与HCM相关。由于心脏对氧化代谢具有特殊的依赖,线粒体作为氧化磷酸系统(oxidative Phosphorylation,OXPHOS)产能的关键,其结构和功能改变在心脏受损中的作用越来越受到关注。迄今为止,超过300个致病线粒体基因(mt DNA)点突变被发现,包括蛋白编码基因、t RNA基因、r RNA基因,并且最常见于线粒体t RNA(mt t RNA)与线粒体蛋白编码基因cytb(mt cytb)中。由于中国对线粒体基因突变报道较少,故中国西南地区、乃至中国人群是否存线粒体基因突变或多态性,突变与多态性是否与原发性心肌病(DCM、HCM)相关,尚无足够证据。故本实验筛选线粒体基因组中最易致变的mt cytb、mt t RNA中的Gln、Ile、Leu、Lys、Pro、Val、Ser七个基因来寻找我国DCM、HCM是否存在线粒体基因突变或多态性,并对比其是否为突变热点或新发突变,探讨线粒体基因改变在中国西南地区患者中的发病状况,并分析其与这两种心肌疾病发病的相关性,进而为我国西南地区汉族人群线粒体基因与原发性心肌病的遗传相关性研究提供更多的证据及方向,并有可能为将来的基因治疗提供理论依据。方法:研究对象选取中国西南地区的汉族人群,其中DCM患者120例,明确家系1例;HCM患者65例,明确家系2例;健康对照者200例。研究对象均行超声心动图、心电图检查,对家系绘制遗传图谱。研究采用病例对照研究,将mt cytb、mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser整个基因序列作为扩增的目的序列,采用DNA试剂盒从患者和健康对照者外周血中提取DNA作为扩增的模板,用primer primer 5软件设计特异性引物、聚合酶链扩增反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增目的序列,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳、Goldview染色技术、紫外线分光仪测量、凝胶成像、Sanger双脱氧链终止法测定所有扩增产物的碱基序列,分析所得的序列图,并将测得碱基序列同线粒体数据库中上述基因的全基因序列进行比对,得出与DCM或HCM相关的多态(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)或突变位点,计算SNP在患者与健康对照者间的频率,用独立样本t检验比较患者与健康对照者之间多态位点频率的统计学差异。突变点与200例健康对照者进行序列比对及分析;对临床伴发听力障碍的早发DCM家系直接行线粒体全基因组测序及分析。结果:1.研究对象临床特点分析:HCM患者心肌明显增厚,多数患者伴轻度心功能不全,心电图改变以T波改变为主。DCM患者全心明显增大,左心功能明显降低,多数患者心功能为中-重度心功能不全(根据NYHA分期),心电图改变以QRS增宽为主。2.HCM患者线粒体基因分析结果:①在mt t RNA Gln基因上发现1个突变位点(m.4395A>G),发现于HCM家系2;HCM家系1、其余HCM患者、DCM患者及200例健康对照者中无此位点改变。此位点碱基由A突变为G,突变位置位于mt t RNA Gln外显子,属于Gln的功能保守区,突变类型为点突变。此位点的突变与突尼斯一散发HCM患者的发现一致,该突变导致mt t RNA Gln结构改变,影响蛋白质翻译过程,为致病性突变的可能极大。②HCM家系1未发现上述基因突变,也未发现mt cytb、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突变或多态位点。③其余HCM患者均未发现mt cytb、mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突变或多态位点。3.DCM患者基因分析结果:①通过与线粒体db SNPC数据库比对(线粒体参考基因组版“NC-012920.1”),在中国西南地区人群中发现了线粒体5个mt cytb基因多态位点,分别为:m.14766C>G(rs527236041)、m.14783C>T(rs527236042)、m.15043G>A(rs527236043)、m.15301A>G(rs527236045)、m.15326 A>G(rs2853508)。mt cytb基因位于线粒体基因组第14747-15887位,整个序列均为外显子,m.15043G>A、m.15301A>G、m.15326 A>G三个位点位于其功能保守区,目前国内外均无m.15043G>A、m.15301A>G两个位点与HCM、DCM相关的报道,m.14766C>G、m.15326 A>G两个位点与丹麦人群HCM多态位点一致,m.15043G>A与美国人群DCM中多态位点一致。②分别计算mt cytb基因5个多态位点在DCM患者和健康对照者中的频率,用SPSS19对二者频率行两独立样本t检验,检验有统计学差异(P<0.05);并且上述多态位点在DCM患者中的频率明显高于健康对照者。由于线粒体遗传遵循严格的母系遗传和遗传瓶颈作用,故其不适用于Hardy-Weinberg平衡及其检验,本实验结果具有患者人群代表性。③在DCM患者mt cytb基因中发现5个新发突变位点,分别是m.15263C>T、m.15290C>A、m.15330T>G、m.15338C>G、m.15386T>G,并且上述位点均位于mt cytb外显子与它的功能保守区。200例健康对照者无上述位点变化。上述突变均为单个碱基的点突变,并造成对应氨基酸的改变,突变位点测序图无杂带出现。④DCM家系患者均伴发听力障碍的儿童患者,本研究对此家系行线粒体全基因组测序,检测结果发现在mt t RNA Glu基因上存在突变位点:m.14696A>G,本研究所有HCM患者、其余DCM患者和200例健康对照者中均无此位点改变。此位点碱基由A突变为G,测序结果分析得突变率为95.98%,突变类型为点突变。芬兰人群曾报道同一突变与线粒体脑肌病相关,但此突变未发现与原发性心肌病相关。⑤中国西南地区DCM患者未发现mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突变或多态位点。结论:1.本研究对象临床特点表明我国西南地区HCM、DCM患者以心力衰竭和心律失常为主要临床表现,多数患者呈散发性,部分呈家族遗传性。2.我国西南地区汉族人群HCM与线粒体基因改变相关性分析:①在我国西南地区HCM家系患者中存在与突尼斯患者相同的线粒体基因突变位点(mt t RNA Gln 4395A>G),已证实该突变位点与HCM发病具有显著的相关性,在中国人遗传背景下其可能是家族性HCM(Familiar Hypertrophic Cardiomyopathy,FHCM)发现的致病基因之一。②我国西南地区汉族人群HCM可能不存在mt cytb、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突变或多态性。3.我国西南地区汉族人群DCM与线粒体基因改变相关性分析:①首次在中国西南地区汉族人群DCM中发现了线粒体5个mt cytb基因多态位点,其中m.15043G>A、m.15301A>G、m.15326 A>G为新发的多态位点,可以作为我国DCM和mt cytb多态位点分析时的一个遗传建议;m.14766C>G、m.15326 A>G两个多态位点属HCM、DCM的共同多态位点,表明线粒体基因多态性也具有遗传异质性的特点。②位于mt cytb基因的五个多态位点在DCM患者中的频率明显高于健康对照者,说明本研究发现的五个多态位点与我国西南地区DCM发病存相关性。③在mt cytb基因中发现了5个新发突变,测序图提示突变均属纯合突变,位于保守区的这五个突变位点极大可能通过影响氧化磷酸化、呼吸链的形成,降低ATP生成、引起线粒体功能障碍而与DCM相关。④我国西南地区汉族人群DCM患者与mt t RNA Glu14696A>G突变相关,该新发突变与我国DCM患者发病相关,结合芬兰研究结果,我们推测该突变位点可能是DCM与线粒体脑肌病所共有;同时分析该突变来源的患者临床特点,推测该突变也可能是伴发听力障碍的早发DCM患者的致病基因之一。此外,在遗传特性明显的家族性DCM中线粒体基因突变具有明显的阈值效应。⑤我国西南地区汉族人群DCM可能不存在mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突变或多态性。