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本研究以甘薯品种栗子香和徐薯18的胚性悬浮细胞为受体材料,建立了一个有效的根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化体系。利用该转化体系,将水稻巯基胰蛋白酶抑制剂(OC’I)基因导入到甘薯品种中,获得了对甘薯茎线虫病具有一定抗性的转基因植株。主要结果如下:
1.以栗子香的胚性悬浮细胞为材料,建立了甘薯有效的遗传转化体系。利用Gus检测分析了乙酰丁香酮浓度对gusA基因瞬时表达的影响,结果表明在共培养基中添加乙酰丁香酮能够显著提高转化效率,适宜的乙酰丁香酮浓度为30 mg I<-1>。对栗子香和徐薯18胚性细胞团的潮霉素敏感性进行了分析,结果表明,选择培养基中适宜的潮霉素浓度分别为25 mg <-1>和7 mg l<-1>。用根癌农杆菌菌株EHA105(携带pCAMBIAl301,含有潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因和B.葡萄糖苷酸酶(gusA)基因)侵染栗子香的1776个胚性细胞团,通过选择培养,获得了289个抗性愈伤组织。将这些抗性愈伤组织转移到再生培养基上,经过体细胞胚胎发生途径,再生出2218株拟转基因植株。GuS检测、PCR、dot blot和Southem blot分析表明,gusA基因已经整合到甘薯基因组中,T-DNA插入拷贝数为1-4个;转基因植株占拟转基因植株的90.37%。将转基因植株移栽到大田,对其块根进行GUs检测,结果表明gusA基因在块根中稳定表达。
2.将质粒pBinh的水稻巯基胰蛋白酶抑制剂(OC I)基因的酶切片段插入到质粒pCAMBIA1301的多克隆位点,构建了质粒pCAMBIAl301-OCI,并将其导入根癌农杆菌菌株EHA105中,构建了植物遗传转化双元载体EHA105/pEAMBIA1301-OCI。
3.利用本研究所建立的遗传转化体系,将OCI基因导入栗子香和徐薯18中。用根癌农杆菌菌株EHA105(携带pCAMBIA1301-OCI)分别转化1450个栗子香的胚性细胞团和1710个徐薯18的胚性细胞团,通过选择培养,分别获得了228个和489个抗性愈伤组织。这些抗性愈伤组织经过体细胞胚胎发生途径,分别再生出1715株和2119株拟转基因植株。通过GUS检测以及PCR、Southern blot和Northern blot分析表明,OCI基因已整合到甘薯基因组中;转基因植株百分率分别为90.29%和92.78%。将这些转基因植株移栽到大田,对徐薯18转基因植株的块根进行甘薯茎线虫接种试验,结果表明,转基因植株块根的感病面积只有24.45-65.04%,而对照(非转基因植株的块根)高度感病,表明表达OCI基因的转基因甘薯植株的茎线虫病抗性明显提高。