两种基于脲酶介导的猪霍乱沙门氏菌和克罗诺杆菌高灵敏免疫分析方法

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传统酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)一般基于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)或者碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)催化底物产生比色信号实现目标物的定量检测,但是由于显色产物的摩尔消光系数小,导致该方法灵敏度偏低,同时显色产物单一的颜色也不利于裸眼检测。因此,基于等离子共振、荧光、化学发光、电化学等新型信号输出的高灵敏ELISA成为当前分析领域的研究热点。动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)是一种测量悬浮液中粒子的散射强度并将其转化成粒子粒径分布的新技术。由于金纳米粒子散射光随粒径的六次方呈正比,因而DLS可作为免疫分析中的一种高灵敏信号输出模式,提高免疫学检测灵敏度。食源性致病菌污染是食品安全的重大问题之一。在我国,每年食物中毒例数在20~40万人,除意外事故外,大部分由食源性致病菌引起。本研究以猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)和克罗诺杆菌(Cronobaacter)为检测对象,建立了基于等离子共振酶联免疫分析法(Plasmonic Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,pELISA)和动态光散射分析(Dynamic Light Scattering Assay)的免疫传感器,实现对目标菌的快速且高灵敏检测。pELISA方法是以脲酶(Urease)诱导棒状金纳米粒子(AuNRs)表面金属化,实现对S.choleraesuis的裸眼和定量检测。其基本原理为Urease催化尿素产生氨气,氨气在硝酸银溶液中形成氢氧化二氨合银的络合物,该络合物进一步被葡萄糖还原形成银单质,沉积在AuNR表面,形成金属化的Au@Ag核壳结构。AuNR在金属化过程中因表面银沉积厚度的不同,表现出不同的局部表面等离子共振(Localized Surface Plasmon Resonance,LSPR),宏观上表现为颜色的差异,这种颜色上的差异可以为裸眼检测提供依据。该方法对S.choleraesuis的裸眼检测浓度为1.21 × 102 CFU/mL,经酶标仪检测LOD为1.21 × 101 CFU/mL,灵敏度较常规ELISA提高2-3个数量级。同时本研究所建立的pELISA具有良好的特异性,与其他九种食源性致病菌无明显的交叉反应;牛奶样本加标回收实验结果显示,该方法检测牛奶样品中S.choleraesuis具有良好的准确度和精密度。其次,建立了基于DLS免疫传感器高灵敏检测Cronobacter的新方法。该方法原理为脲酶催化尿素产生氨气,氨气在硝酸银溶液中形成氢氧化二氨合银的络合物,该络合物进一步被葡萄糖还原,形成以金纳米花(AuNFs)为核的AuNF@Ag核壳纳米结构。本研究利用该特性结合免疫磁分离技术实现婴儿配方奶粉中Cronobacter的高灵敏检测。在实验参数最优情况下,该方法对莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii ATCC 51329)的检测线性范围为3.4×102 CFU/mL-3.4×108 CFU/mL,LOD为3.9×101 CFU/mL,检测灵敏度相比于常规ELISA提高了 3个数量级。加标回收实验结果显示,该方法的平均回收率在87.9%-107.91%之间,变异系数在2.72%-9.32%之间,表明该方法具有较高的准确性和精密度。
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