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普鲁兰酶是一种专一性切割α-1,6-糖苷键的脱支酶。它被应用于酿造工业、淀粉工业、氨基酸工业等生物加工工业中,是淀粉加工中不可或缺的非大宗关键酶制剂。然而,由于技术的限制,我国还未拥有自主知识产权的普鲁兰酶生产。
本研究根据GenBank公布的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因突变体序列(AX203843)合成普鲁兰酶成熟肽基因。合成后基因插入载体pUC18获得重组质粒pUC-pulA。由重组质粒pUC-pulA中扩增出普鲁兰酶基因,并将其插入到表达载体pET-28a得到重组质粒pET-28a-pulA。将重组质粒pET-28a-pulA转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,该重组菌的细胞破碎液有酶活,由此表明该普鲁兰酶基因具有活性功能,能正确表达普鲁兰酶。
将普鲁兰酶突变体基因与质粒pHY-WZX相连接,转化枯草芽孢杆菌WB600,得到重组菌WB600(pHY-WZX-pulA),普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到表达并且是胞外酶。进一步将重组质粒pHY-WZX-pulA转入到地衣芽孢杆菌B60608,实现了普鲁兰酶在重组地衣芽孢杆菌B60608(pHY-WZX-pulA)中表达。
重组地衣芽孢杆菌B60608(pHY-WZX-pulA)的酶活由优化前的0.115 ASPU／mL提高到5.12 ASPU／mL,在发酵罐上的酶活力为12.32 ASPU／mL,原初发菌株地衣芽孢杆菌B60608没有普鲁兰酶酶活。发酵优化后的发酵培养基为:甘油7％,硫酸铵为0.4％,药媒为2.5％,磷酸盐为11.75 mmol／L。优化后的发酵条件为:重组菌种子液培养温度42℃,种子液初始pH7.0,接种量10％,种龄16 h,发酵温度30℃,发酵培养基初始pH6.5。
重组酶具有良好的酶学性质,其最适反应温度50℃,65℃以上重组酶酶活力迅速降低；重组酶在60℃以下保温2 h基本保持稳定；最适反应pH为3.5；重组酶在pH4.0-pH7.0基本保持稳定。Mg2+、Mn2+、Li+、Na+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Co2+等金属离子对重组酶有促进作用,而K+离子对重组酶没有明显作用；化学试剂EDTA和Tween20对重组酶也有激活作用；SDS对重组酶有明显的抑制作用。