目的通过对培养于浅层角膜基质上的角膜缘上皮细胞进行深低温保存,检测复苏后细胞的结构及活性,将细胞培养片移植到角膜缘干细胞严重损伤的异体模型兔角膜缘,并观察移植治疗效果,为角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞应用于临床提供实验依据。方法实验室阶段:(1)角膜缘上皮细胞的原代培养:将切削的兔浅层角膜缘组织剪成1mm×1mm大小组织块,用含20%胎牛血清的细胞培养液培养于细胞培养瓶中,至细胞形成单层;(2)角膜缘上皮细胞种植于去上皮浅层角膜基质上传代培养:将原代培养的细胞经VTP(0.25%胰酶和0.02%EDTA V:V=1:1)消化制成单细胞悬液,滴加在去上皮浅层角膜基质载体上继续培养至细胞形成2～3层;(3)载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存:将培养于角膜基质载体上的角膜缘上皮细胞放入冷冻保存液中按阶段降温保存在液氮罐中,冷冻保存液由90%胎牛血清+10%二甲基亚砜(DMSO)配成;(4)原代培养的角膜缘上皮细胞鉴定:采用倒置显微镜、电镜及免疫细胞化学染色鉴定培养的细胞的性质;(5)深低温保存前后载体上角膜缘上皮细胞形态比较及鉴定:通过倒置显微镜、电镜、HE染色及免疫细胞化学染色来比较培养的角膜缘上皮细胞的形态结构及生物学活性。动物实验阶段:将30只白兔制成角膜缘干细胞损伤模型,随机分成角膜基质组、新鲜培养细胞组及培养细胞深低温保存组,每组10只,分别用单纯的角膜基质、未冷冻及冷冻后的培养有角膜缘上皮细胞的角膜基质载体做移植实验,观察移植后一段时间受体角膜的眼表改变。结果(1)原代培养的角膜缘上皮细胞经VTP消化制成单细胞悬液,接种于去上皮浅层角膜基质载体上继续培养,细胞生长良好并能很好地附着在角膜基质载体上,传代培养第14天,载体上细胞可形成2～3层,经增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体免疫细胞化学染色呈阳性反应;(2)深低温保存前后角膜缘上皮细胞形态学变化和活性状况有所差异:倒置显微镜下观察可见冷冻复苏后细胞呈圆球形,与基质载体疏松相连,继续培养4～5天后,细胞渐伸展呈多边形,复苏后培养期间可见部分细胞脱落死亡;透射电镜检查也显示冻存后细胞的超微结构与未冻存培养细胞相比有轻度改变;(3)同种异体移植实验:兔角膜缘干细胞损伤模型制作术后5周,可见角膜大量新生血管长入并伴有结膜上皮入侵。以基质载体培养的角膜缘上皮细胞未冷冻及冷冻复苏后培养一周移植,移植术后一月,损伤角膜表面逐渐上皮化,角膜新生血管仅限于角膜缘,而对照组(仅移植角膜基质)术后一月,角膜上皮细胞仍然缺失,新生血管未见明显变化。结论以浅层角膜基质为载体进行角膜缘上皮细胞培养,可培养出复层上皮细胞,经深低温保存后仍保持上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用来作异体角膜缘移植治疗角膜缘功能缺陷的角膜病。