多肽是由α-氨基酸通过酰胺肽键连接而成的生物分子,在各种生理和病理活动过程中发挥重要作用。多肽类药物已被广泛用于多种疾病如肿瘤、心血管疾病和糖尿病等的治疗。多肽类药物主要通过化学合成策略获得,其中固相多肽合成方法应用最为广泛。蜈蚣毒素多肽RhTx是从中国红头蜈蚣的毒液中提取得到的一种毒素多肽。RhTx由27个氨基酸残基组成,分子中含有两对二硫键。RhTx作为激动剂能够特异性的靶向辣椒素受体TRPV1通道的外孔区域,通过变构调节促使TRPV1的开放,从而产生剧烈的疼痛,已成为研究TRPV1通道的有效工具。蜘蛛毒素多肽GsMTx4是从Grammostola spatulata蜘蛛的毒液中提取得到的一种毒素多肽。GsMTx4由34个氨基酸残基组成,分子中含有三对二硫键。GsMTx4是目前报道的唯一特异性靶向Piezo通道的抑制剂。Piezo通道的突变与涉及机械传导的多种遗传性人类疾病有关。RhTx和GsMTx4是研究TRPV1和Piezo通道生理机制以及进行合理药物设计等的重要分子工具。然而,RhTx和GsMTx4的自然丰度较低,传统的蛋白质重组表达方法难以获取足量的目标多肽,化学方法是获取数十毫克量级的RhTx和GsMTx4的有效途径。Oxyma/DIC缩合体系具有抑制外消旋、耦合效率高、成本低和安全等优点,在多肽合成中具有良好的应用能力,探索Oxyma/DIC缩合体系在高温条件下的最佳反应比例,建立快速高效的固相多肽合成方法具有重要理论意义和应用价值。二硫键对于维持RhTx和GsMTx4的二级结构发挥核心作用,二硫键的氧化折叠是多肽合成的关键步骤。探索三种主流的氧化折叠策略对于二硫键构象锁定多肽的合成具有较大参考意义。本研究的第一部分建立了RhTx的高效固相化学合成和体外复性折叠策略,实现了RhTx的快速制备。1、使用高效稳健的HCTU/DIEA缩合体系,在常温条件下合成了3条RhTx线性肽:RhTx-1（四个Cys侧链巯基均裸露的线性肽）,RhTx-2（1.3-Cys的侧链巯基被Acm保护的线性肽）,RhTx-3（2.4-Cys的侧链巯基被Acm保护的线性肽）。2、在高温条件下探索Oxyma/DIC缩合体系合成多肽的最佳反应比例,合成了6条RhTx线性肽:RhTx-4（1.3-Cys的侧链巯基被Acm保护的线性肽）,四个Cys的侧链巯基均裸露的线性肽RhTx-5、RhTx-6、RhTx-7、RhTx-8和RhTx-9。3、为了探索RhTx氧化折叠的正确性以及不同氧化折叠策略对多肽复性效率及产率等的影响,分别使用一次氧化折叠、两次氧化折叠和一锅法氧化折叠策略对RhTx进行复性。本研究第二部分建立了GsMTx4的高温固相化学合成方法和体外复性折叠策略,实现了GsMTx4的高效制备。1、利用HCTU/DIEA缩合体系,在常温的条件下合成了线性肽GsMTx4-1。2、在高温的条件探索Oxyma/DIC缩合体系合成多肽的最佳反应比例,合成了3条GsMTx4线性肽,即GsMTx4-2、GsMTx4-3和GsMTx4-4。3、4条线性肽均通过一次氧化折叠策略进行复性。利用分析型RP-HPLC和ESI-MS评价复性的效率和收率。利用CD以及膜片钳活性测试等评价复性后多肽的结构及生物学活性。结果表明:1、在50℃条件下,增大Oxyma或DIC的反应比例,RhTx和GsMTx4的分离收率均没有明显提高,说明Fmoc-氨基酸:Oxyma:DIC=4 eq:4 eq:8 eq为最佳反应比例,可以实现氨基酸的快速缩合。2、两次氧化折叠策略的分离收率（40%～45%）高于一次氧化折叠策略（30%～40%）和一锅法氧化折叠策略（10%～25%）;一锅法氧化折叠策略可能会导致较大比例的错误折叠;1.3-Cys或2.4-Cys的侧链巯基被Acm保护的线性肽在两次氧化折叠的过程中没有明显差异。3、所有线性肽和目标多肽分离后纯度均可达到95%以上。4、分析型RP-HPLC、ESIMS、CD以及活性测试等数据表明,三种不同的氧化折叠策略均可以得到正确折叠的RhTx,通过不同合成和复性条件得到RhTx的结构和活性没有差异;5、通过一次氧化折叠策略均可得到正确折叠的GsMTx4,分离收率为25%～30%,在不同条件下合成的GsMTx4的结构和活性没有差异。6、CD以及活性测试等表明二硫键对于维持多肽的结构和活性等发挥至关重要的作用。综上,本论文探索了DIC和Oxyma缩合体系的最佳比例,发展了高温固相多肽合成策略,建立数十毫克量级RhTx和GsMTx4的高效快速化学合成和体外复性折叠方法,系统研究了一次氧化折叠、两次氧化折叠和一锅法氧化折叠策略对复性效率和收率的影响。本论文的研究不仅为TRPV1和Piezo等离子通道研究提供关键分子工具,而且为多肽分子特别是二硫键构象锁定多肽的合成提供了重要参考。