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急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是犬常见疾病之一,由于缺乏敏感的早期诊断标志物而延误治疗,所以发病率和死亡率一直居高不下。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（Neutrophil gelatinase-related apolipoproteins,NGAL）是人和其它动物 AKI早期诊断的重要分子标志物,但犬AKI的病因不同,NGAL能否作为犬AKI早期诊断敏感标志物有待进一步研究。为此,本研究首先建立了犬肾脏缺血-再灌注（Ischemia-reperfusion,I/R）损伤模型,通过分子诊断标志物的比较研究,明确了 NGAL也是早期诊断犬I/R-AKI的敏感标志物。进而利用重组大肠杆菌表达的犬NGAL抗原制备单克隆抗体,建立了检测犬NGAL的双抗体夹心ELISA方法,并利用犬AKI临床样品对建立的ELISA方法进行验证,为NGAL在犬AKI早期诊断中的应用提供了理论依据和诊断试剂。1.犬I/R-AKI模型的建立及其诊断标志物的比较研究为了探明NGAL能否作为早期诊断犬I/R-AKI的分子标记,将12只比格犬随机分为对照组和I/R组,I/R组手术摘除右肾,左肾动、静脉用无损伤血管夹夹闭60 min后进行再灌注,然后进行手术缝合。对照组打开腹腔,摘除右肾后直接缝合。在再灌注后12 h和72 h,分别采集两组犬的肾脏组织进行病变观察,结果显示I/R组呈现典型的AKI病变,包括肾小管刷状缘消失、管腔内淤血、内皮细胞变性坏死、管腔内有蛋白管型或管腔狭窄。在再灌注后不同时间采集两组犬的血样和尿样,利用全自动生化分析仪检测血液尿素氮（BUN）、血清肌酐（sCr）和尿肌酐（uCr）,采用ELISA检测血清NGAL（sNGAL）和尿NGAL（uNGAL）。结果与对照组相比,I/R组的sCr在再灌注后24 h显著升高,36 h超过参考值上限,60 h达到峰值;uNGAL/uCr 比值（UNCR）从再灌注2 h开始迅速上升,6～60 h期间保持较高水平;uNGAL和sNGAL从再灌注后2h快速上升,12h达到峰值,随后逐渐下降。ROC分析显示uNGAL和sNGAL检测灵敏度显著高于sCr（P<0.0001）,特异性无显著差异。在再灌注后12 h和72 h分别采集两组犬的肾组织进行qRT-PCR和免疫组化比较分析,进一步证明NGAL是早期诊断犬I/R-AKI的敏感分子标记。2.犬NGAL单克隆抗体的制备与鉴定为了开发具有自主知识产权的犬NGAL检测试剂,根据犬NGAL基因序列设计引物,从比格犬肾组织提取总RNA,用RT-PCR扩增犬NGAL成熟肽编码序列,将其插入pET28a（+）表达载体,转化大肠杆菌后利用IPTG诱导重组蛋白表达,利用镍亲和柱纯化重组蛋白。以纯化的犬重组NGAL免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,免疫转印进行单克隆抗体鉴定。结果显示克隆的犬NGAL编码序列与发表序列的同源性为100%,重组大肠杆菌表达的犬NGAL为预期的25 kDa,纯化的重组蛋白纯度大于90%;经过3轮克隆化筛选,获得6株阳性杂交瘤细胞株,细胞培养上清的 ELISA 抗体效价分别为 1:10240、1:64000、1:32000、1:10240、1:32000 和 1:64000,小鼠腹水单抗的 ELISA 效价分别为 1:64000、1:128000、1:128000、1:64000、1:128000、1:128000,均能与犬NGAL发生特异性反应,纯化抗体效价均大于1:1024000。上述结果提示制备的单克隆抗体可以用于犬NGAL检测试剂的研发。3.犬NGAL双抗体夹心ELISA的建立目前国内尚无犬NGAL诊断试剂盒上市。本研究以犬重组NGAL为抗原,利用相加ELISA对6株单克隆抗体的NGAL结合位点进行检测,然后用双抗体夹心ELISA筛选最佳抗原-抗体配对,根据单因子分析结果确定双抗体夹心ELISA的最佳反应条件,通过临床血清和尿液样品检测批内、批间变异系数和回收率,并用18只健康犬和18只AKI犬的血样和尿样,与进口 ELISA试剂盒进行平行检测。结果显示:6株单克隆抗体中,NC-1、NC-3的NGAL结合位点相同,NC-2、NC-4、NC-5、NC-6的抗原结合位点相同,其中NC-5和NC-3的P/N值最高,因此选为ELISA的捕捉抗体和检测抗体。捕捉抗体的最佳包被液为50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）,包被浓度为2 μg/mL;最佳封闭液为含1%酪蛋白的PBST（含0.05%Tween 20的PBS）,封闭条件为37℃封闭3 h;检测样品反应条件为37℃孵育45min;检测抗体最佳稀释倍数为1:8000,反应条件为37℃孵育45 min;底物反应条件为室温避光孵育10 min。用纯化的犬NGAL重组蛋白描绘标准曲线,双抗体夹心ELISA的检测限为0.292 ng/mL。检测低浓度和高浓度NGAL血清样本的批内变异系数分别为8.63%和6.70%,批间变异系数分别为10.34%和7.48%;检测低浓度和高浓度NGAL尿样的批内变异系数分别为8.33%和4.54%,批间变异系数分别为10.01%和4.62%。血样和尿样平均回收率分别为91.9%和96.7%。与进口犬NGAL检测试剂盒相比,本研究建立的双抗体夹心ELISA检测血样和尿样NGAL的符合率分别为97.18%和99.06%,可以用于犬NGAL的检测。4.犬NGAL双抗体夹心ELISA在AKI诊断中的应用为了验证双抗体夹心ELISA能否用于犬AKI的早期诊断,本研究共采集27个品种犬血样256份和尿样106份,根据BUN、sCr检测及临床症状,将纳入病例分成健康对照组、细小病毒感染组和不明原因腹泻组（非肾脏病组）,将肾病犬分为AKI组和慢性肾脏病组,用双抗体夹心ELISA检测sNGAL和uNGAL浓度,并计算UNCR。在初诊后第5日,对非肾病组uNGAL高于临界值的11只犬进行BUN、sCr、uCr、sNGAL、uNGAL检测及UNCR计算。结果显示,在血样检测的256只犬中,40例为健康犬,52例为细小病毒感染犬,50例为不明原因腹泻犬,60例有急性肾损伤,54例有慢性肾脏病。非肾损伤组的sNGAL、uNGAL、UNCR差异不显著,显著低于（P<0.0001）肾损伤组,其中急性肾损伤组的sNGAL显著（P<0.0001）高于慢性肾病组,uNGAL和UNCR与慢性肾病组无显著差异。在1 1只复诊犬中,8只犬的BUN、sCr浓度超过正常值上限,sNGAL和uNGAL浓度升高,结合临床症状诊断为AKI。这些结果表明建立的NGAL双抗体夹心ELISA可以用于犬AKI的早期诊断。