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棉花是在国民经济中占重要地位的经济作物,黄萎病现已成为影响生产的严重因素之一。防治黄萎病根本方法是培育和应用抗病品种。因此,了解棉花抗黄萎病的信号途径,分离抗病相关基因,已成为棉花分子生物学研究的重点内容之一。国内外学者研究表明,SCF信号复合体作为泛素途径一类重要的E3连接酶,在介导R基因的抗性、茉莉酸反应、乙烯反应等植物抗病反应中起着重要作用。研究以本课题组构建的中植棉KV1 SSH文库为基础,克隆了棉花泛素途径SCF信号复合体中的GhSKIP35(Skp1-interacting partner 35)基因,并对其功能进行了较为详细的研究,取得的主要结果如下:1.通过基因电子克隆、5?RACE、3?RACE成功克隆出GhSKIP35基因全长。GhSKIP35基因开放阅读框(ORF)为1863 bp,编码620个氨基酸;通过与拟南芥、鹰嘴豆、甜橙、番茄、土豆、葡萄等10种植物SKIP35基因编码的氨基酸序列比对有76.63%的总体同源性,并且,都有相同的保守区域。通过系统进化树分析,显示GhSKIP35与甜橙的SKIP35蛋白的关系最近,同源性最高。通过对GhSKIP35蛋白氨基酸保守区域分析,发现其含有1个长达100多个氨基酸的锚蛋白重复序列。2.实时荧光定量PCR分析显示,在接种大丽轮枝菌V991菌系后初期棉花根部GhSKIP35基因表达量激增,12 h便可达到顶峰,24~48 h逐渐下降,这表明,GhSKIP35基因为黄萎病菌上调瞬时诱导表达基因,推测它在陆地棉抗黄萎病早期防卫反应中起重要作用。3.利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing)技术,在中植棉KV3中成功地沉默GhSKIP35基因;对沉默棉株接种大丽轮枝菌V991鉴定显示,其病情指数为50.75,而野生型的中植棉KV3和转化空载体棉株的病情指数分别为9.38和11.54。GhSKIP35基因沉默后,中植棉KV3对黄萎病的抗性由高抗水平下降到高感水平,抗性级别由最高级降到最低级别,其黄萎病抗性完全丧失,表明GhSKIP35基因在陆地棉抗黄萎病的过程中起重要作用。4.构建了超表达载体,利用农杆菌浸花法将其转入拟南芥中,将GhSKIP35基因在拟南芥中超量表达之后,导致拟南芥对黄萎病的抗性由感病变为耐病。这说明,棉花GhSKIP35基因在抗黄萎病反应中起重要作用。通过本研究,成功克隆一个抗黄萎病相关新基因GhSKIP35,这为将来通过基因工程手段培育棉花抗黄萎病新品种提供了候选基因。