乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中产生的一种高分子聚合物,由于菌株基因多样性以及EPS结构的多样性使得EPS生理活性也具有多样性,在各个领域都具有很大的潜在利用价值。本研究着眼于植物乳杆菌YM 4-3菌株胞外多糖合成中参与寡糖重复单元的合成过程的两种糖基转移酶(orf1595及cps4I),通过对这两个基因进行敲除和回补,并结合基因敲除后菌株的转录组数据共同分析,进而对这两种糖基转移酶基因的功能进行初步确定。此外通过对糖基转移酶基因敲除后的菌株的生长特性及其抗菌活性进行检测,从而评估这两种糖基转移酶对菌株生理特性的影响。对基因敲除株以及野生型菌株的胞外多糖进行提取并作含量、化学成分以及体外抗菌活性和抗氧化活性进行分析从而评估这两种糖基转移酶对胞外多糖生理活性的影响,结合单糖组分测定结果从而明确两种糖基转移酶基因的功能,进而为胞外多糖生物合成调控做一定的理论基础。具体研究内容及结果如下:(1)基于温敏载体针对orf1595与cps4I基因目的敲除片段成功构建获得基因敲除载体pFED76-Δorf1595及pFED76-Δcps4I。并将其转化入宿主菌株并经同源重组获得基因敲除菌株植物乳杆菌YM 4-3-Δorf1595及YM 4-3-Δcps4I。基于同样的原理,成功获得基因回补菌株植物乳杆菌YM 4-3-orf1595及YM 4-3-cps4I。(2)基于上述试验所构建的基因敲除菌株及基因回补菌株对其胞外多糖进行提取并测定其含量,结果显示YM 4-3-Δorf1595菌株胞外多糖含量为53.7±2.76mg/L,YM 4-3-Δcps4I菌株胞外多糖含量为23.8±0.364 mg/L,而YM 4-3野生型菌株其产量为74.75±0.254 mg/L,基因敲除后胞外多糖产量下降。基因回补菌株YM 4-3-orf1595胞外多糖产量为80.85±1.344 mg/mL(p<0.05),YM 4-3-cps4I胞外多糖产量为70.4±0.973 mg/mL(p>0.05),胞外多糖产量得以恢复。(3)通过转录组测序情况分析基因敲除菌株的表达差异情况。糖基转移酶基因敲除后会使得胞外多糖合成基因簇中部分基因表达差异变化,还会导致菌株糖代谢途径中的基因出现表达差异。(4)对敲除菌株所产胞外多糖的体外DPPH清除、羟基自由基清除及超氧阴离子自由基清除进行检测评估基因敲除对其胞外多糖抗氧化活性的影响。结果发现糖基转移酶基因敲除后胞外多糖的DPPH及超氧阴离子自由基清除能力显著降低,但其羟基自由基的清除明显升高,当胞外多糖浓度达400μg/mL具有60%以上的清除活性。(5)对敲除菌株及野生型菌株所产胞外多糖的蛋白质含量、糖醛酸含量以及硫酸盐含量进行检测,结果发现基因敲除后会引起胞外多糖化学成分的变化。