论文部分内容阅读
前言:淋巴瘤是一种淋巴源性细胞克隆性增殖所致的恶性肿瘤,按照组织病理学特点可分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma,HL）和非霍奇金淋巴瘤（non Hodgkin lymphoma,NHL）。弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是NHL最常见的一种亚型,临床表现为高度侵袭性且常伴有骨髓浸润,该病恶性程度大,进展迅速,预后差。近年来随着免疫化疗方案的问世和普及,DLBCL患者的生存率取得了长足进步,但40%患者仍然会进展为复发难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（recurrent/refractory diffuse large B-cell lymphoma,R/R-DLBCL）,死亡率高达23.3%,严重危害人类健康。DLBCL涉及大量的基因突变、拷贝数变异和染色体核型异常。在细胞和分子遗传学水平研究MYCT1在DLBCL发生发展中作用机制有助于发现DLBCL诊治和预后判定的分子靶标。染色体不稳定性（chromosomal instability,CIN）是恶性肿瘤细胞的重要特征之一,表现为染色体数目异常和结构异常,可见于多种实体肿瘤及恶性血液系统疾病。研究表明,特异性标记染色体已成为慢性粒细胞白血病等肿瘤诊断、治疗及预后判定的分子靶点,因此,围绕该领域展开研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。MYCT1（Myc target 1）是由本课题组应用分子生物学等方法在喉癌中首先发现并克隆鉴定的基因,定位于染色体6q25区域,曾命名为源于喉癌细胞的c-Myc靶基因（c-Myc target from laryngeal cancer cell,MTLC）。目前研究显示,MYCT1在不同的肿瘤细胞中发挥不同的生物学作用,具有组织特异性。然而,MYCT1在包括DLBCL在内的淋巴瘤中的作用与机制研究未见报道。前期,本课题组在稳转MYCT1的喉癌细胞中发现若干与淋巴源性恶性疾病发生发展有关的差异表达基因,其中包括RUNX1（runt-related protein1）。RUNX1是一重要转录因子,与MYCT1类似,其在不同肿瘤中的作用也呈两面性,且在淋巴瘤的研究中还存在争议。进一步研究,我们发现MYCT1和RUNX1在淋巴瘤中分别低表达和高表达,同时,淋巴瘤细胞核型分析结果显示MYCT1位点存在缺失,RUNX1位点存在扩增,提示MYCT1和RUNX1在淋巴瘤中可能发挥相反作用。前期,我们还发现在喉癌组织中MYCT1与MAX（MYC-associated factor X,MAX）存在相互作用。生物信息学预测结果显示,RUNX1启动子区存在MAX潜在结合位点。鉴于MYCT1和MAX广泛表达于多种正常组织,我们推测MYCT1可能通过与MAX相互作用在转录水平调节RUNX1的表达进而参与淋巴瘤的发生发展。本研究中,我们拟应用细胞和分子遗传学相关技术研究MYCT1对淋巴瘤细胞核型、增殖、凋亡及周期的影响并探讨相关的分子机制,为MYCT1相关通路在淋巴瘤诊治和预后判定分子标志物的深入研究提供重要线索和依据。材料与方法:1、实验材料:伴有骨髓浸润的淋巴瘤骨髓标本、淋巴瘤石蜡包埋组织切片标本、人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系DB、SU-DHL4。2、实验方法:细胞培养、基因转染、染色体核型分析、荧光原位杂交、实时定量PCR、Western blot、流式细胞术、CCK-8检测细胞增殖、免疫共沉淀、免疫组织化学染色、染色质免疫沉淀技术、双荧光素酶报告基因活性检测等。结果:1、核型分析结果（1）伴有骨髓浸润的209例淋巴瘤患者中78例（37.3%）检测出核型异常,核型异常组患者平均总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression free survival,PFS）均显著低于核型正常组（P<0.001）,而三年死亡率显著高于染色体核型正常组（P<0.001）。（2）78例核型异常患者中68例（87.2%）表现为复杂核型,染色体畸变共发生589次,其中,数目畸变占53.8%（317/589）,常见为三体型和单体型。3号、6号、11号染色体总体累及率最高,分别占7.65%（45/589）、7.31%（43/589）及6.97%（41/589）;结构畸变占46.2%（272/589）,最常见累及6号、11号、14号,分别占12.5%（34/272）、10.3%（28/272）及8.5%（23/272）,涉及的最小重叠区（smallest region of overlapping,SRO）最多为14q32-qter、6q21-25、11q23-qter,分别占6.6%（18/272）、5.9%（16/272）及4.8%（13/272）。2、78例核型异常患者的荧光原位杂交结果显示,20例患者存在MYCT1缺失,16例患者存在RUNX1扩增,其中5例同时存在MYCT1缺失和RUNX1扩增。3、实时定量荧光PCR和Western blot结果显示,在淋巴瘤骨髓浸润患者及石蜡包埋组织切片中,MYCT1 m RNA及蛋白表达水平均较对照组显著降低（P<0.05）,而RUNX1 m RNA及蛋白表达水平均较对照组显著增高（P<0.05）。4、对稳转MYCT1过表达载体的DLBCL细胞核型分析结果显示,MYCT1过表达组DB细胞系存在2号染色体短臂与8号染色体长臂相互易位以及一条7号染色体的长臂等臂异常;SU-DHL4细胞系存在18号染色体短臂、22号染色体短臂9号染色体短臂的插入以及一条7号染色体短臂的缺失。5、CCK8结果显示,与对照组相比,48小时后MYCT1稳转细胞系增殖能力显著降低（DB组P<0.05、SU-DHL4组P<0.01）,72小时后,增殖水平进一步降低。6、流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,稳转MYCT1过表达载体后DB及SU-DHL4细胞凋亡水平均显著增加（P<0.01）。7、流式细胞术检测细胞周期结果显示,稳转MYCT1过表达载体的DB、SU-DHL4细胞G0/G1期的数目比例明显增多（P<0.05）,而S期及G2/M期未见显著变化。8、实时定量PCR及Western Blot结果显示,在稳转MYCT1过表达载体的人DLBCL细胞系DB、SU-DHL4细胞中,RUNX1 m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低（P<0.05）。而敲减MAX可显著回复MYCT1对RUNX1表达水平的影响（P<0.05）9、免疫共沉淀结果显示,在DLBCL细胞中MYCT1与MAX存在相互作用。10、生物信息学预测结果显示,RUNX1启动子区存在MAX潜在结合位点。双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,在敲减MAX的DLBCL细胞中,荧光素酶活性较对照组显著降低（P<0.05）。染色质免疫沉淀结果显示,MAX能够与RUNX1启动子区结合,且过表达MYCT1能够显著抑制MAX募集至RUNX1启动子区（P<0.001）。结论:1、染色体核型异常的淋巴瘤患者总生存期及无病生存期缩短、3年死亡率高,提示染色体核型异常是淋巴瘤预后不良的因素之一。2、淋巴瘤染色体异常涉及到三个最小重叠区:14q32-qter、6q21-25、11q23-qter,其中MYCT1位于6q21-25,提示MYCT1在淋巴瘤中存在潜在作用。3、在淋巴瘤患者中,MYCT1表达下调,RUNX1表达上调,二者表达水平呈负相关,提示MYCT1和RUNX1在淋巴瘤中分别发挥抑癌基因和癌基因作用。4、MYCT1过表达引起DLBCL细胞系DB和SU-DHL4染色体核型改变,MYCT1是否具有维持染色体稳定性从而抑制肿瘤的发生有待进一步研究。5、MYCT1抑制DB、SU-DHL4细胞增殖、促进细胞凋亡并将细胞阻滞于G0/G1期。6、在DLBCL中MYCT1与MAX蛋白存在相互作用。7、MAX可能是RUNX1转录因子。8、MYCT1通过MAX抑制RUNX1转录从而抑制DB、SU-DHL4细胞增殖,促进细胞凋亡。