荧光假单胞菌是引起水产品、乳制品和肉制品等食品腐败变质的一种耐冷性腐败菌。乳酸菌素是乳酸菌产生的一种对它种微生物具有拮抗作用的次级代谢产物,具有安全稳定、高效广谱等优势广泛应用于食品防腐保鲜领域。本文从传统发酵食品、鱼类肠道等自然生态环境分离的乳酸菌中筛选对荧光假单胞菌具有较强抑制活性的产乳酸菌素菌株。对菌株产生的乳酸菌素进行分离纯化,并分析其分子组成及结构。从细胞损伤、DNA转化和蛋白表达三个层面对荧光假单胞菌的拮抗作用机制进行探究,同时,作为生物防腐剂对牙鲆的保鲜效果进行验证。主要结论如下:(1)应用牛津杯打孔法从639株乳酸菌中筛选出146株对假单胞菌具有抑制活性的乳酸菌菌株。通过排除有机酸和过氧化氢试验,从146株乳酸菌中筛选出1株分离于大菱鲆肠道的产乳酸菌素菌株DLP1。通过形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,菌株DLP1为植物乳杆菌,命名为植物乳杆菌DLP1。(2)应用乙酸乙酯萃取、超滤、Sephadex G-25凝胶层析和RP-HPLC四步法分离纯化出纯度较高的抗菌活性物质plantaricin DLP1。应用Tricine-SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS 确定 plantaricin DLP1 的分子量为 1537 Da。应用MALDI-TOF-MS/MS结合N端测序分析其氨基酸序列为DFGFDIPDEVEVR,经Blast比对确定plantaricin DLP1为一种新的植物乳杆菌素。Plantaricin DLP1对食品中常见的腐败菌(铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌)和致病菌(单核细胞增生李斯特氏菌、哈维弧菌和金黄色葡萄球菌)具有广谱抑菌作用,在pH 2.0-6.0具有抑菌活性,且121℃处理15 min仍保持较好的热稳定性,对蛋白酶敏感。(3)应用扫描电镜、透射电镜、荧光探针和流式细胞仪等方法从细胞损伤和DNA转化层面解析plantaricin DLP1对荧光假单胞菌的作用机制。Plantaricin DLP1与荧光假单胞作用后,首先,损伤荧光假单胞菌的细胞外膜,增大其渗透性,使其能够进入细胞;其次,作用于细菌细胞膜,耗散细胞膜的跨膜电位和pH梯度,增大细胞膜渗透性,破坏细胞膜的完整性且形成孔洞,导致DNA和蛋白质等胞内物质发生泄漏;第三,进入细胞内部抑制DNA和RNA的合成,使细胞凋亡数增加;最后,导致细胞死亡,达到抑菌的作用。(4)应用ITRAQ技术从蛋白质表达水平进一步探究plantaricin DLP1对荧光假单胞菌的抑菌机制,共获得320个差异蛋白,其中151个蛋白表达量下调,169个蛋白表达量上调。OprO和TolQ蛋白表达量均上调,推测孔蛋白OprO是plantaricin DLP1穿过细胞外膜的载体蛋白,肽转运蛋白TolQ是plantaricin DLP1穿过细胞膜的载体。细胞外膜渗透性相关的阿拉伯糖-5-磷酸异构酶、dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase和DegT/DnrJ/EryC1/StrS家族转氨酶三个蛋白表达量的上调,说明plantaricin DLP1可以破坏荧光假单胞菌细胞外膜的完整性。细胞膜渗透性相关蛋白SstT和AtpD表达量上调,表明plantaricin DLP1增大了细胞膜的渗透性,造成胞内离子物质的泄漏。此外,GltX、TrpS、AspS、ValS、PheT、30S核糖体蛋白(S1、S3、S4、S5、S7)和50S核糖体蛋白(L1、L22)等蛋白下调,说明plantaricin DLP1抑制了荧光假单胞菌蛋白质的合成。调节DNA复制过程的单链DNA结合蛋白、DnaJ和DnaK和参与DNA转录过程的蛋白NusG、RpoA和TF表达量都下调,表明plantaricin DLP1阻碍了荧光假单胞菌DNA复制和转录过程。(5)从细胞损伤、DNA转化和蛋白表达三个层面推测plantaricin DLP1对荧光假单胞菌的作用机制可能为:首先,plantaricin DLP1通过孔蛋白OprO穿过细胞外膜;其次,借助细胞膜肽转运蛋白TolQ穿过细胞膜;第三,进入细胞内部抑制DNA、RNA和蛋白质的合成;最后,破坏细胞膜的完整性,使其胞内物质外泄,导致细胞凋亡和死亡。(6)通过测定细菌菌落总数、TVB-N、pH、质构特性及感官等评价指标,研究plantaricin DLP1作为牙鲆鱼片生物防腐剂的应用效果。结果表明,plantaricin DLP1通过抑制细菌菌落总数和荧光假单胞菌总数的增加,从而延缓了 TVB-N和pH的增加,使牙鲆鱼片货架期由原来的6 d延长为8-10d,且保持较好的质构特性及感官分值。因此,plantaricin DLP1作为控制假单胞菌的水产品生物防腐剂具有潜在的应用价值。