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研究背景恶性肿瘤的发病率逐年升高,为人类致死的主要原因之一。放射治疗做为治疗恶性肿瘤的三大主要手段之一,其作用和地位日益突出。然而肿瘤细胞在放疗过程中的辐射耐受成为限制放疗疗效的主要问题,肿瘤细胞的辐射增敏研究成为近年来的研究热点。肿瘤细胞内凋亡抑制蛋白IAPs（Inhibitors of Apoptosis Proteins,IAPs）的过表达已被证实为与肿瘤的辐射耐受密切相关,其高表达会抑制细胞凋亡,降低肿瘤的辐射敏感性。第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（Smac,Second mitochondria-derived activator of caspase）可以与IAPs直接结合,拮抗其抑制凋亡的功能,从而促进细胞凋亡、提高肿瘤的放疗敏感性。Smac蛋白类似物作为一种促凋亡蛋白,在受到凋亡诱导因素（射线辐射、抗癌药物、化学信号、紫外线和其他DNA损伤等）的作用时,可与其他线粒体蛋白（如细胞色素-c等）穿透线粒体膜释放到胞浆中参与凋亡调节,可显著提高辐射诱导的肿瘤细胞凋亡,有望成为一种新型肿瘤辐射增敏药物。Smac氨基端的7个氨基酸残基---Smac N7,是Smac蛋白中最小的活性单元,能够抑制IAPs而发挥辐射增敏作用,但正常条件下Smac N7单独无法顺利进入细胞。有研究证实,果蝇Antennapedia蛋白（ANTP）同源结构域的位列第3位的α-螺旋结构区域（43到58之间共16个氨基酸残基基团）是具有转导作用的最小功能区域,该蛋白可直接与脂质双分子层结合、实现跨膜运动从而进入胞内,而不依赖通道、介体、通路或胞吞作用,不消耗能量。本实验选择ANTP蛋白作为引导肽,合成ANTP-Smac N7融合多肽,在引导肽的作用下,使功能肽Smac N7进入肿瘤细胞,观察其促进肺癌细胞凋亡、辐射增敏作用。本实验项目意在探索能够提高肿瘤放疗疗效的新型辐射增敏药物。目的本研究旨在探讨新型Smac蛋白类似物ANTP-Smac N7融合肽对肺癌细胞系A549的辐射增敏作用,分析其潜在的作用机制,为肺癌的放疗辐射增敏提供理论基础。分析肺癌细胞系A549细胞及H460细胞Smac蛋白、IAPs家族蛋白表达与辐射敏感性的关系。内容本研究分三个部分第一部分:用ANTP蛋白的ANTP9多肽作为引导肽,Smac N7做为功能肽,合成ANTP-Smac N7融合多肽。在融合蛋白羧基末端用FITC（异硫氰酸酯荧光素）进行标记,以便于观察该融合蛋白是否具有细胞穿透的功能。取对数期生长的细胞,培养过程中加入ANTP-Smac N7融合多肽。用DAPI溶液染色作为对照组,确定细胞核的位置。倒置荧光显微镜下观察融合多肽进入细胞的情况。第二部分:对数生长期肺癌A549细胞进行分组,分为空白对照组,单纯照射组,ANTP组,Smac N7组,ANTP-Smac N7组和照射联合ANTP-Smac N7组等实验组。ANTP-Smac N7组、照射联合ANTP-Smac N7组中ANTP-Smac N7的浓度为20μmol/L。通过克隆实验观察ANTP-Smac N7融合多肽的辐射增敏作用。细胞凋亡实验流式细胞仪测定不同组细胞处理后的细胞凋亡率。应用彗星实验检测DNA损伤程度。采用尾矩（Tail moment,TM）、尾部DNA含量（Tail DNA%,TDNA%）以及Olive尾矩（Olive Tail Moment,OTM）来评价分析指标定量检测ANTP-Smac N7融合多肽对辐射诱导的A549细胞DNA损伤的作用。Western blot实验检测Cyto-C、PARP、caspase8、caspase3、caspase9的活化表达水平。给予caspase抑制剂z-VAD（不可逆泛caspase-inhibitor）后,克隆实验检测融合多肽对辐射增敏作用的变化,Western blot法比较PARP、γ-H2AX表达差别。分析ANTP-Smac N7融合多肽辐射增敏的可能机制。第三部分:相同实验条件下比较A549与H460两种肺癌细胞株的辐射敏感性,Western blot实验检测两种细胞Smac,XIAP,c IAP1,c IAP2蛋白的表达量,通过两种肺癌细胞不同IAP家族部分蛋白XIAP、Smac的表达量,分析两者不同辐射敏感性的可能机制。为进一步的动物和临床实验打下一定的理论基础。结果第一部分:在ANTP的帮助下,Smac N7功能肽可顺利进入细胞内,并在肿瘤细胞蓄积到一定浓度。这为下一步融合多肽顺利进入细胞、发挥作用做好铺垫,使下一步的实验得以进行。第二部分:1.照射+ANTP-Smac N7组的克隆形成率明显降低,差异有统计学意义A融合多肽能够增强A549细胞的辐射敏感性（p<0.01）。2.ANTP-Smac N7单独作用时对细胞的促凋亡作用不明显,在联合组,融合多肽促凋亡作用在辐射的基础上明显增高。3.照射+ANTP-Smac N7融合肽组TDNA%、TM和OTM均高于其他各组,差异有统计学意义（均p<0.05）,表明ANTP-Smac N7融合多肽显著增强电离辐射诱导的DNA损伤。4.Western blot检测不同实验组肺癌A549细胞caspase、PARP蛋白表达水平,实验结果表明ANTP-Smac N7融合多肽促进辐射诱导细胞凋亡caspase的活化,增加C-PARP表达水平,发挥对A549细胞的辐射增敏作用。5.加入Caspase抑制剂z-VAD后融合多肽对A549细胞辐射增敏作用减弱,细胞存活率曲线介于单纯照射组与照射联合ANTP-Smac N7融合多肽组之间。6.ANTP-Smac N7融合肽明显增加辐射导致的A549细胞DNA双链断裂,给予caspase抑制剂z-VAD可降低细胞凋亡,但不能减少DNA双链断裂水平。第三部分:A549细胞存活率高于H460细胞,辐射耐受性强于H460。A549细胞Smac低表达,而XIAP高表达。A549细胞中凋亡抑制蛋白（IAPs）家族中另外两个蛋白c IAP1和c IAP2的表达量都不高。结论ANTP-Smac N7融合多肽可以顺利进入肺癌肿瘤细胞内,ANTP-Smac N7融合肽可显著增强电离辐射诱导的DNA损伤,促进辐射诱导细胞凋亡caspase3,8,9的活化,明显提高A460细胞的辐射敏感性。ANTP-Smac N7融合多肽为一种新的Smac蛋白类似物有望用于肿瘤的辐射增敏治疗。A549细胞Smac低表达,而XIAP高表达,正是其产生辐射耐受性强于H460的分子基础。