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【目的】探究诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)分化为神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的过程中,细胞内锌离子浓度的变化趋势;探讨不同浓度的外源性锌离子对iPSCs神经分化的影响;对锌离子影响神经分化的机制进行初步探索,为基于诱导多潜能干细胞的神经再生治疗提供新的思路。【方法】将人类牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,hGF)重编程得到的iPSCs进行体外培养,使用Gibco公司生产的PSC Neural Induction Medium将iPSCs诱导为NSCs,利用流式细胞仪检测表面标志物、免疫荧光检测NSCs标志物对诱导后的细胞进行鉴定;在诱导过程中,利用共聚焦显微镜及锌离子探针BTA观察细胞内锌离子的相对浓度;通过向培养基内添加不同浓度的氯化锌(2.5-20μM)、锌离子螯合剂N,N,N’,N’-四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)(0.5-2μM),改变细胞所处环境的锌离子浓度,CCK-8法及细胞凋亡试剂盒分别检测细胞增殖活性及凋亡比例;根据增殖及凋亡试验的结果,后续实验中培养基内添加的氯化锌浓度为2.5μM、5μM、10μM,TPEN浓度为1μM。利用Image J软件对诱导后的各组细胞神经突长度进行测量;Western blot检测NSCs标志物Nestin、ERK-STAT信号通路中ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表达量,并使用Image J软件进行灰度值分析;ELISA检测NSCs标志物Nestin的表达情况。使用ERK抑制剂VX-11e阻断ERK激活,分析Nestin、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达变化。【结果】1.成功将hGF重编程得到的iPSCs诱导为NSCs,诱导得到的细胞形态与iPSCs不同,不再呈聚集状生长,而是单层贴壁生长,单个细胞形态呈不规则的星状或放射状,有神经突样结构;免疫荧光染色结果显示细胞阳性表达NSCs标志物Nestin、Pax6和Sox2;流式细胞术结果显示细胞表面标志物CD133阳性表达,CD34、CD45阴性表达;2.荧光探测结果显示改变培养基内的锌离子浓度后,细胞内的锌离子浓度也发生了相应变化,并且在神经诱导过程中,细胞内锌离子浓度呈不断升高的趋势;诱导完成、传代后,NSCs细胞内的锌离子浓度显著高于iPSCs(p<0.05);3.与对照组相比,当培养基内添加的Zn Cl2浓度达到20μM、TPEN浓度达到2μM时,细胞的增殖发生了明显的抑制(p<0.05),细胞凋亡试验可见当TPEN的浓度达到2μM时,凋亡比例有所升高;4.神经诱导7天后,添加Zn Cl2的细胞Nestin表达量显著增加(p<0.05),但各浓度之间(2.5μM、5μM、10μM)未见明显差异(p>0.05);添加TPEN的细胞Nestin的表达量显著降低(p<0.05);同时添加Zn Cl2和TPEN的细胞Nestin表达量与对照组相比未见明显差异(p>0.05);神经诱导第3天时,添加5μM Zn Cl2的细胞的Nestin表达量与第7天时对照组的表达量未见明显差异(p>0.05),说明添加锌离子后iPSCs向NSCs分化的速度加快;5.各组细胞的ERK1/2、STAT3磷酸化水平变化趋势与Nestin表达量的变化趋势相近,在添加Zn Cl2后磷酸化水平上升,添加TPEN后磷酸化水平降低;使用VX-11e阻断ERK活化后,STAT3的磷酸化也被明显抑制,且阻断后各组的Nestin表达水平不随锌离子的增加或减少而变化。【结论】1.向培养基内添加或螯合锌离子会引起细胞内的锌离子浓度改变,在iPSCs神经诱导过程中,细胞内的锌离子浓度具有不断升高的趋势;2.锌离子能够显著提高hGF来源的iPSCs在体外向NSCs分化的潜能;3.锌离子可能是通过ERK-STAT信号通路起作用,调控iPSCs的神经分化。