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柑橘褐斑病（Alternaria brown spot,ABS）是由交链格孢菌橘致病型（Alternaria alternata pathotype tangerine）所引起的一种严重危害柑橘的真菌病害,该病害传播速度非常快、发生的范围非常广泛,给感病柑橘品种的生产带来了严重的损害。但是目前柑橘褐斑病在我国仍属于一种新病害。效应蛋白是病原菌侵染寄主过程中分泌的一种可以增强自身毒力的小分子物质,在植物与病原菌的漫长的互作过程中一直起着关键性的作用。在细菌和卵菌中效应蛋白的研究体系已经趋向成熟了,但在病原真菌中,效应蛋白的研究进展一直非常缓慢,对于柑橘褐斑病菌效应蛋白的研究能够揭示柑橘褐斑病菌与柑橘之间的分子互作关系,使得我们更好的了解柑橘感病和抗病中基因层次的原因,同时该研究也为柑橘褐斑病的防治及培育柑橘抗病品种提供理论方面的有力指导,对于柑橘其他病原真菌的研究起到一定的借鉴作用。本论文在前人完成的褐斑病菌全基因组测序和实验室前期已经筛选鉴定了部分效应蛋白的基础上,系统筛选剩余候选效应蛋白基因,解析效应蛋白基因的毒性和无毒性功能,分析诱导寄主细胞死亡的和抑制BAX诱导PCD的效应蛋白基因功能,解析其作用机制及与柑橘互作中可能发挥的作用。主要结果如下:1.借助农杆菌介导的烟草瞬时表达在候选效应蛋白基因中系统筛选发现18个效应蛋白Aa SP4、Aa SP16、Aa SP28、Aa SP43、Aa SP52、Aa SP93、Aa SP114、Aa SP152、Aa SP163、Aa SP55、Aa SP97、Aa SP138、Aa SP38、Aa SP131、Aa SP136、Aa SP71、Aa SP128、Aa SP151在烟草细胞中过表达能够诱导烟草叶片组织发生过敏性坏死反应,其中Aa SP4、Aa SP16、Aa SP28本实验室前期已做了部分研究,Aa SP6、Aa SP13、Aa SP162、Aa SP64 4个效应蛋白能够抑制由Bax诱导的PCD。2.通过生物信息学分析发现柑橘褐斑病菌能够诱导寄主细胞死亡的十八个效应蛋白基因在其它非链格孢菌基因组中没有同源基因,说明这些效应蛋白基因在生化功能上具有一定的保守性。通过种内测序发现这18个效应蛋白基因在柑橘褐斑病菌不同的生理小种中多态性不高,说明褐斑病菌的效应蛋白在柑橘褐斑病菌的整个进化过程中具有比较高的保守性。3.通过生物信息学分析发现除了信号肽之外,18个坏死效应蛋白基因中不存在共同的motif,但Aa SP67、Aa SP114、Aa SP136、Aa SP152、Aa SP162、Aa SP151、Aa SP128、Aa SP64、Aa SP93、Aa SP16、Aa SP138、Aa SP28、Aa SP71、Aa SP43、Aa SP55、Aa SP52、Aa SP97中存在共同的motif1;Aa SP114、Aa SP152、Aa SP162、Aa SP16、Aa SP71、Aa SP163之间存在共同的motif2;Aa SP114、Aa SP151、Aa SP28、Aa SP163之间存在共同motif3;Aa SP114、Aa SP67、Aa SP136、Aa SP128、Aa SP64之间存在共同的motif4。4.实时荧光定量PCR显示这18个效应蛋白基因都能够在柑橘褐斑病菌侵染红橘过程中诱导表达,其峰值在接种后的12 h。其中Aa SP16、Aa SP38、Aa SP71在接菌后表达量明显上调,在6h时Aa SP16、Aa SP71相对表达量即达到近20倍,且这3个基因在侵染过程中呈现持续的诱导表达;Aa SP128这个基因仅在第12h时能够监测到其表达;基因Aa SP97在柑橘褐斑病菌侵染柑橘的过程中呈现下调的表达模式;基因Aa SP152在整个侵染过程中表达量差异比较小,在整个过程中一直比较稳定。这些结果表明柑橘褐斑病菌效应蛋白基因呈现不同的表达模式,预测这18个分泌蛋白基因可能分别参与褐斑病菌与寄主互作的早期、中期和后期的识别以及对寄主防御反应的调控过程。5.利用Split-marker方法构建9个关键效应蛋白Aa SP52、Aa SP16、Aa SP163、Aa SP6、Aa SP13、Aa SP138、Aa SP128、Aa SP43、Aa SP71基因敲除盒,通过转化得到各个基因的缺失突变株。通过菌落形态及菌丝生长速率观测发现PDA培养基上部分基因的缺失突变株产生了色素变异,部分有黑色素沉积。Aa SP52、Aa SP128、Aa SP71基因的缺失突变体部分表现为生长速率的下降,部分缺失突变株的生长速率与野生型菌株几乎无差异,有些缺失突变株甚至表现为生长速率的上升;Aa SP163、Aa SP138、Aa SP43、Aa SP16的缺失突变株均表现为生长速率的下降,说明这几个基因的缺失对褐斑病菌的生长造成了阻碍。通过对突变株环境胁迫实验,发现缺失突变体对逆境胁迫具有不同的适应性,与野生对照相比,正常培养基上所有缺失突变体生长速率减慢,Aa SP128基因的缺失突变体对所有胁迫均敏感;Aa SP138、Aa SP16基因的缺失突变株对测试的刚果红和山梨醇等逆境不敏感敏感,但对其他逆境较为敏感。致病性测定结果显示除了抑制BAX诱导PCD反应的Aa SP6和Aa SP13号基因以外,所有能够造成烟草叶片坏死的效应蛋白基因的缺失突变体致病力显著下降,上述结果表明,这些效应蛋白基因参与调控柑橘褐斑病菌致病性。6.对4个效应蛋白基因进行酵母双杂交实验,通过酵母双杂交系统筛选到目的蛋白的互作蛋白,最终经测序分析,诱饵Aa SP16筛选得到35个与诱饵蛋白互作的阳性克隆、诱饵Aa SP52筛选得到17个与诱饵蛋白互作的阳性克隆、诱饵Aa SP128筛选得到19个与诱饵蛋白互作的阳性克隆、诱饵Aa SP163筛选得到28个与诱饵蛋白互作的阳性克隆。7.对能够抑制BAX诱导PCD反应的两个效应蛋白基因Aa SP6、Aa SP13进行生物信息学分析、种内和种间多态性分析、基因表达量分析、基因敲除发现Aa SP13编码柑橘褐斑病菌角质酶基因,种内序列比较保守、这2个效应蛋白基因都能够在柑橘褐斑病菌侵染红橘过程中诱导表达,其峰值分别在接种后的36 h和第48h,呈现明显的上调表达模式。通过将缺失突变株与野生型菌株比较发现这两个基因的缺失对于致病力的影响不大,可能在其他方面起作用。