人FGF8b蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性研究

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:minlu123
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目的:通过昆虫杆状病毒载体表达系统表达重组人成纤维细胞生长因子-8b(FGF-8b),优化表达条件,纯化后研究其对1-甲基4-苯基吡啶(MPP+)诱导建立的帕金森(Parkinson disease,PD)病细胞模型的保护作用及其抗凋亡机制。  方法:目的基因FGF8b和转移载体pFastbac双酶切后连接,连接产物pFastbac-FGF8b鉴定后进一步转化至DH10Bac感受态细胞,目的基因同源转座至Bacmid中,通过蓝白斑实验重复筛选获得高纯度穿梭载体Bacmid-FGF8b。重组阳性质粒通过脂质体包装后转染Sf9昆虫细胞,收获的病毒重复转染扩大病毒滴度。收获的蛋白用SDS-PAGE,Western blot进行鉴定。为了提高蛋白产量,分别对病毒侵染时间和侵染病毒滴度进行探索优化。在最佳表达条件下收获细胞沉淀超声破碎后通过肝素亲和层析柱纯化获得目的蛋白FGF8b。NIH3T3细胞检测蛋白促增殖作用。为了研究FGF8b的神经保护作用,利用MPP+诱导PC-12细胞建立帕金森细胞模型检测其促增殖和抗凋亡作用,并进一步通过实时定量PCR和Western blot确定其抗凋亡作用机制。  结果:人FGF8b成功在昆虫细胞中表达,肝素纯化后蛋白纯度>90%,蛋白产量为2.78mg/L。细胞活性检测证实纯化的重组蛋白能显著促进NIH3T3细胞生长,在0.5 ng/ml~64ng/ml之间呈剂量依赖性。FGF8b对帕金森细胞模型有保护作用,并且FGF8b通过与FGFR3结合降低MPP+诱导PC-12细胞建立帕金森细胞模型的GRP78和caspase12蛋白的表达。  结论:成功在IC-BEVS中表达分子量约为23kDa,具有生物学活性的FGF8b重组蛋白。FGF8b通过介导内质网应激途径对MPP+诱导PC-12细胞建立帕金森细胞模型起保护作用。
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