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细胞色素P450单加氧酶是一类催化未活化碳氢键羟化的酶,广泛分布于自然界。不同于经典的电子传递链自给自足的P450BM3,另一类电子传递链自给自足的CYP116B亚家族单加氧酶,其电子传递链的组成与P450BM3不同。相比于P450BM3,CYP116B单加酶的底物特异性和其氧化功能尚未进行系统的探索研究。基于对这类酶的活力指纹分析,我们发现它对底物四氢萘具有较好的羟化活力,但是仍然存在电子偶合效率低、热稳定性和反应选择性不高等缺陷。产物(S)-四氢萘醇是合成美洛培南的前药,也是阿片受体样受体激活剂和酪氨酸激酶抑制剂的重要砌块。我们以该手性萘醇为目标产物,通过分子进化提高来自于CYP116B亚家族P450LaMO的催化性能,包括电子偶合效率和催化选择性。本论文内容主要分为以下三个部分。第一部分,CYP116B单加氧酶的底物特异性研究。我们设计并合成了四类有代表性的甲醚类底物,包括单萜类、环烷烃类、芳香化合物类和甾体类,以揭示新一类自给自足P450单加氧酶对于不同底物的羟化反应活性。羟化产物甲醛可与Purpald显色染料专一性结合形成稳定的蓝紫色络合物,该显色方法被用于检测三个新成员单加氧酶P450RpMO、P450CtMO和P450ArMO的脱烷基活力。同时对该显色方法进行可靠性和可行性验证,结果表明:甲醛浓度范围在2-100 μM之间时,其加标回收率在84%-104%。而且与色谱检测进行方法比较,脱烷基活力与显色吸光值A550呈正相关。基于此显色方法,绘制了三个成员酶的脱烷基活力指纹图谱。通过深入分析,发现所选成员酶对以1,2,3,4-四氢萘为核心结构的衍生物具有较高的催化活性。第二部分,通过分子进化提高来自于团聚拉布伦茨氏菌P450单加氧酶(P450LaMO)的催化活力。我们采用跨结构域重组(Transdomain Combination Mutation,简称TDCM)策略提高其比活力。氧化酶部分引入三点突变(N119C/V264A/V437G)后,突变体的转化频率(turnover frequency,TOF)以及电子偶合效率(coupling efficiency,CE)分别提高了 7.8倍和3.0倍。而还原酶部分的双点突变体M612L/K774Y具有更高的细胞色素c还原活力(298 U/mg protein),相对于母本(7.7 U/mg protein)提高了 39倍,这说明还原酶部分的突变可以介导更有效的电子传递,最终该突变体的TOF和CE分别提高了 4.9倍和4.2倍。通过将两个结构域的突变体进行组合,获得的组合突变体 N119C/V264A/V437G/M612L/N694D 的 CE 提高了 9.1 倍,TOF 提高 10 倍,同时该突变体的热稳定性(T5010)也提高了 3.8℃。利用该突变体催化其它四氢萘衍生物的羟化时,催化活力也有不同程度的提升。实验结果表明,这一策略不仅可以有效地改善P450LaMO全酶的催化性能,而且可为该家族其它成员酶的分子进化发挥指导性作用。第三部分,通过分子进化提高细胞色素P450KaMO的对映选择性和产物选择性。首先对酶的底物口袋内五个位点进行苯丙氨酸扫描,这使得产物的对映体比率e.r.从66:34提高至RJ1(T121F)的e.r.=93:7,产物的选择性(醇酮比,a.k.)也从76:24提高至92:8。在RJ1 基础上通过点饱和引入Y385F/M391L获得RJ2(T121F/Y385F/M391L),其e.r.=95:5,a.k.=95:5。最后通过对T121位点的极性进行优化,获得突变体RJ3(T121V/Y385F/M391L),生成(S)-构型萘醇的对映选择性e.r.为98:2,产物选择性a.k.为99:1,同时TOF和TTN分别为0.71 min-1和1360,这相对于母本(0.04 min-1,116)分别有18倍和12倍左右的提高。与此同时,突变体RJ6(T121F/E282V/T283Y)实现了产物构型的翻转,产物(R)-萘醇的对映选择性e.r.为23:77,产物选择性a.k.为76:24。在对突变体RJ2进行T121位点极性优化时,我们发现突变体RJ33(T121P/Y385F/M391L),其TOF与TTN分别提高了 21倍和18倍左右,分别达0.84 min-1和2104,但是对映选择性略有下降,产物选择性e.r.为95:5。为了研究对映选择性和活力提高的原因,我们进行了底物和产物分子的模拟对接,结果显示:在T121位点引入突变,使得过氧化发生的几率下降而羟化循环能力增强,主要得益于酶活性口袋疏水作用的增强。同时外在因素包括助溶剂种类和比例、温度以及pH也不同程度地影响了酶的产物选择性。总之,通过CYP116B家族成员酶指纹图谱分析发现对苯基烷烃具有羟化反应活性,但是活力和选择性均不够理想。为了克服上述缺点,我们通过跨结构域重组进化和关键区域突变扫描的方法分别提高其活性和选择性,最终获得的突变体可以有效催化苯基烷类化合物的不对称羟化。