血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells,VECs）遭遇缺血会发生不同程度的损伤,严重者将发生部分或全部坏死,最终影响缺血性疾病（脑梗塞、心肌梗塞、皮瓣缺血、下肢缺血等）患者的生存质量。细胞自噬在组织细胞成活中具有“双刃剑”作用:轻度细胞自噬能够分解功能障碍细胞器,为细胞提供能量,具有促进细胞成活作用;而过度细胞自噬能够造成组织细胞损伤,可能是造成VECs损伤的新机制。前期研究发现:缺血再灌注能够诱导人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）发生适度细胞自噬与过度细胞自噬,适度细胞自噬对短时间缺血HUVECs具有一定的保护作用;另外,自噬分解的产物可为细胞能量代谢提供底物。因此,缺血时也会导致细胞能量代谢状态发生改变,即可能改变三羧酸循环和无氧糖酵解状态。由此,项目组提出“抑制过度细胞自噬维持自噬平衡及调控细胞能量代谢有利于减轻VECs缺血性损伤”的科学假设。最终为VECs缺血坏死的防治奠定初步的理论基础和提供新的治疗靶点;为各类缺血性疾病新药的筛选提供一个新的技术平台;为降低缺血性疾病坏死率、提高患者生存质量提供一种全新的思路与解决办法。第一部分建立HUVECs缺血模型目的:构建HUVECs的缺血模型,并选择一个合适的缺血时间。方法:采用不含葡萄糖和胎牛血清的缺血培养基,pH 6.8,37℃,在低氧培养箱（O2:CO2:N2 1%:5%:94%）中培养HUVECs并进行检测。结果:缺血时间分别设定为0,3,6,9及12h时,≥6h细胞会破碎无法收集到细胞提取蛋白行Western Blot检测。缺血时间设定为0,1,2,3,4,5及6h时,细胞经历4h以上的缺血处理（缺氧+营养缺乏）后,细胞会破碎无法收集到细胞提取蛋白行Western Blot检测。流式细胞术的结果提示缺血组和缺血再灌注组的凋亡率无统计学差异。结论:3小时缺血模型为HUVECs缺血可靠模型;缺血和营养物质缺乏均不会激活Beclin-1/LC3-Ⅱ依赖的经典信号通路自噬。第二部分蛋白质组学与生物信息学分析缺血对HUVECs自噬平衡的影响目的:研究缺血状态下HUVECs的自噬状态和细胞能量代谢状况。方法:设置缺血3h组、缺血3h/再灌注24h组及对照组（n=3）,分别送蛋白质组学检测与生物信息学分析。结果:蛋白表达量非常明显表现出生物重复性的特征。缺血HUVECs的同源蛋白簇（Eukaryotic Orthologous Groups,KOG）主要集中在能量代谢方面,如C,E,F,G,H,I,以及细胞骨架Z方面,而非胞核Y方面。上调的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）提示显著性差异的上调蛋白大多数集中于能量代谢和溶酶体。自噬信号通路提示:ATG5/12/16有激活,而Beclin-1/LC3-Ⅱ未被激活。结论:生物信息学分析进一步验证了缺血未激活Beclin-1/LC3-Ⅱ依赖的经典途径,有可能激活了非经典途径细胞自噬。第三部分验证缺血对HUVECs和游离皮瓣自噬平衡的影响目的:应用Eestern Blot和CCK8方法验证缺血对HUVECs自噬平衡的影响,并用游离皮瓣进行深入验证。方法:设置缺血3h组和对照组HUVECs（n=3）,采用Western Blot和CCK8方法进行检测;并检测游离皮瓣成活面积。结果提示:丙酮酸激酶1具有下调趋势;柠檬酸合成酶显著上调,印证了蛋白质组学的结果。棕榈酰辅酶A（Palmitoyl-Co A）+亲和素（Avidin）抑制三羧酸循环却增加细胞活性;而丙酮酸（Pyruvate）+醋酸盐（Acetate）促进三羧酸循环却协同降低细胞活性。雷帕霉素（Rapamycin）不能上调或下调缺血HUVECs细胞活性,亦不能增加或减少游离皮瓣成活面积;高剂量的氯喹（Chloroquine）25μM组细胞活性显著下调并且游离皮瓣成活面积显著下降。结论:缺血HUVECs不是通过糖酵解提供能量,而是通过柠檬酸合成酶途径提供能量,以维持细胞成活;但是三羧酸循环可能是把“双刃剑”。打破自噬平衡可降低细胞活性及减少游离皮瓣成活面积。