卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤,病死率一直位居妇科恶性肿瘤之首。浆液性卵巢癌(serous ovarian carcinoma,SOC)是其中最常见以及恶性程度最高的亚型,五年生存率仅为30%。究其根本原因在于对卵巢癌的发生发展的分子机制认识不清,临床上缺乏早期有效的诊断分子标记物及治疗靶点。因此,阐明卵巢癌发生发展的分子机制以及筛选相关的分子标记物,对于其早期诊断和治疗靶点的确立具有重要价值。mTOR信号通路通过整合细胞内外多种信号刺激,参与细胞的周期调控、增殖、凋亡以及自噬等重要生理过程。并与许多疾病的发生发展密切相关,包括肿瘤、肥胖、Ⅱ型糖尿病以及神经退行性疾病等。肿瘤中常存在mTOR信号通路的调控异常,根据肿瘤基因组数据库,在人类上皮性卵巢癌中普遍存在mTOR信号通路的异常激活,并且mTOR信号通路的激活与上皮性卵巢癌的不良预后密切相关。结节性脑硬化复合物-1(Tuberous sclerosis complex,TSC1)与TSC2交互作用形成二聚体复合物,该复合物是mTOR信号通路的重要内源性抑制分子。TSC1/TSC2的基因突变或者低表达会导致TSC1-TSC2复合物的功能异常,继而引起mTOR信号通路的过度激活。TSC1通过抑制TSC2的泛素化起到稳定TSC2的作用。大量文献资料显示TSC1基因在多种癌症中出现表达下调的趋势,如乳腺癌、结直肠癌以及膀胱癌等,也有研究表明TSC1在浆液性卵巢癌中低表达,提示我们:TSC1有望成为浆液性卵巢癌诊断和治疗的新靶点。microRNA(miRNA)是一类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA,它们通过结合到mRNA的3’非翻译区(un-translation region,UTR)来实现对靶基因的调控。而我们注意到TSC2的3 ’UTR仅仅为117nt,而TSC1的3 ’UTR为4887nt。所以我们推测TSC1更容易受到microRNA的调控。因此本研究致力于寻找靶向调控TSC1的miRNA,从而实现对mTOR信号通路的调控,为浆液性卵巢癌的诊断和治疗提供新的靶点。因此本研究主要分为三部分:第一部分:miR-130a在浆液性卵巢癌中靶向调控TSC1目的:明确TSC1在浆液性卵巢癌组织中的表达及临床意义,筛选和鉴定可以靶向抑制TSC1的miRNA。方法:western blot及免疫组织化学染色检测高级别浆液性卵巢癌组织和对照正常输卵管伞中TSC1的表达差异;分析TSC1与浆液性卵巢癌分期的等临床信息的相关性。利用Targetscan、miRDB、PicTar等软件分析TSC1的3’UTR区域,预测可能调控TSC1的microRNA,发现miR-130a、miR-27和miR-204是可能调控TSC1的候选microRNA。利用瞬时转染的方法,将候选miRNAs分别转入A2780和SKOV3细胞系,检测TSC1表达情况,初步确定miR-130a可能调控TSC1。进一步用western blot检测A2780和SKOV3细胞系miR-130a上调和下调后,mTOR信号通路的关键蛋白的变化。利用双荧光素酶报告实验证明TSC1是否为miR-130a的靶基因。QPCR检测高级别浆液性卵巢癌组织和正常输卵管伞中miR-130a的表达情况,并进行癌组织中miR-130a与TSC1相关性分析。结果:相比于正常输卵管伞组织,TSC1在高级别浆液性卵巢癌组织中普遍低表达,表达水平与高级别浆液性卵巢癌患者的临床分期呈负相关,即TSC1表达水平越低,其临床分期越晚。候选miRNA瞬时转染后,只有转入miR-130a的一组出现TSC1的低表达。miR-130a过表达后,mTOR信号通路中的mTOR复合物、p70S6K和4E-BP1磷酸化水平均上调,即mTOR信号通路过度激活。反之,miR-130a低表达后,mTOR信号通路被抑制。双荧光素酶报告实验中,miR-130a可以抑制TSC13’UTR的野生型质粒的荧光素酶活性,对突变型质粒无显著影响。同时miR-130a在高级别浆液性卵巢癌组织中高表达,并与TSC1表达水平呈负相关。结论:TSC1在浆液性卵巢癌中普遍低表达,并与其临床分期密切相关;miR-130a直接靶向调控TSC13’UTR,从而抑制其表达,进而激活mTOR信号通路;miR-130a在高级别浆液性卵巢癌组织中高表达,并且与TSC1表达水平呈负相关。第二部分:miR-130a对浆液性卵巢癌增殖、侵袭和自噬的影响目的:第一部分结果中已经明确miR-130a与TSC1之间的靶向调控关系,那么miR-130a过表达后和敲低后所产生的效应如何,miR-130a在浆液性卵巢癌发生发展中扮演怎样的角色,这些问题的解决都需要进一步的实验论证。因此这一部分主要探究miR-130a对浆液性卵巢癌细胞系增殖和侵袭能力的影响。除此之外,基于第一部分的结论,我们认为miR-130a主要通过mTOR信号通路发挥作用。所以这一部分的另一个重点是明确miR-130a是否影响依赖于mTOR信号通路的细胞自噬。方法:通过慢病毒感染构建miR-130a稳定过表达的3种卵巢癌细胞系。用上述细胞系进行平板克隆形成实验,软琼脂克隆形成实验和MTT实验,以反应miR-130a对浆液性卵巢癌细胞系增殖能力的影响;通过Transwe1l assay探究miR-130a对浆液性卵巢癌细胞侵袭能力的影响;同时western blot检测EMT相关蛋白变化以明确miR-130a是否影响EMT过程。采用Rescue实验探讨过表达TSC1是否可以逆转miR-130a所引起的细胞增殖和侵袭能力的提高。构建裸鼠皮下移植瘤模型、肺转移模型,以进一步明确miR-130a对浆液性卵巢癌细胞的体内致瘤能力和肺转移能力的影响。利用Rapamycin以及细胞饥饿处理来诱导细胞自噬,miR-130a过表达或者低表达后检测自噬相关分子标记物,以明确miR-130a对细胞自噬的影响。GFP-RFP-LC3腺病毒感染A2780细胞系后,共聚焦显微镜观察miR-130a过表达以及低表达后自噬流变化趋势。结果:miR-130a过表达后,3种卵巢癌细胞系的体外增殖能力,克隆形成能力以及侵袭能力均增强。同时我们发现miR-130a过表达可以显著影响EMT相关分子的表达,促进EMT过程进而影响细胞侵袭能力。miR-130a低表达后,上述卵巢癌细胞系的恶性生物学行为被削弱。裸鼠体内实验证明:miR-130a促进浆液性卵巢癌细胞的体内致瘤能力及肺转移能力。Rescue实验证明TSC1过表达后可以削弱miR-130a引起的mTOR信号通路的过度激活,及细胞增殖和侵袭能力的增强。通过检测自噬相关分子表明:miR-130a过表达抑制Rapamycin或者饥饿所诱发的细胞自噬,而miR-130a低表达促进细胞自噬。自噬流检测显示:miR-130a过表达后,自噬小体以及自噬溶酶体均减少。而miR-130a低表达后自噬小体及自噬溶酶体均增多。结论:miR-;130a通过靶向抑制TSC1激活mTOR信号通路,一方面促进细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为,另一方面抑制细胞自噬,从这两个方面促进卵巢癌的发生发展。第三部分:miR-130a在浆液性卵巢癌中受到NF-κB信号通路调控目的:已有研究表明,miR-130a在多种肿瘤中表达上调,本课题也已明确其在浆液性卵巢癌中高表达并促进其恶性生物学行为,但其高表达的上游调控机制尚未阐明。有研究提示NF-κB信号通路的激活可以上调miR-130a的表达,但并未明确两者之间的直接调控关系。因此这一部分研究侧重于阐明miR-130a在浆液性卵巢癌中是否受到NF-κB信号通路的直接调控。方法:利用LPS和TNF-α激活NF-κB通路,QPCR和western blot检测miR-130a-TSC1-mTOR通路关键分子的表达情况。利用NF-κB信号通路的抑制剂PDTC或者p65 siRNA阻断该信号通路后,再次检测miR-130a-TSC1-mTOR通路关键分子的变化情况。将miR-130a启动子区域连接到双荧光素酶报告载体上,进行luciferase实验。用anti-p65抗体进行ChIP实验以进一步证明miR-130a启动子区域存在NF-κBp65的结合位点。结果:LPS和TNF-α激活NF-κB通路后,miR-130a的表达水平升高,TSC1表达水平降低,mTOR信号通路激活。NF-κB通路抑制剂或者p65 siRNA可以有效下调miR-130a,并显著削弱TNF-α所诱导的mTOR信号通路的过度激活。双荧光素酶报告实验证明TNF-α激活NF-κB通路后促进含有miR-130a启动子区域(F2区域)质粒的荧光素酶活性。初步证明miR-130a启动子F2区域存在NF-κB复合物的结合位点。在有或无TNF-α条件下,用anti-NF-KBp65抗体进行ChIP实验,发现TNF-α显著促进NF-κB p65与miR-130a启动子区域(site1,site2,site4)的结合,而site4位点与NF-κB p65的结合并不依赖于TNF-α。结论:在浆液性卵巢癌中,NF-κB通路通过结合在miR-130a启动子区域,促进miR-130a的转录,继而激活mTOR信号通路,促进浆液性卵巢癌的发生发展。综上所述:本研究重点阐明了 miR-130a促进浆液性卵巢癌发生发展的分子机制,并阐明了其上游及下游调控机制。本研究的创新点与研究意义:1.首次从miRNA角度阐明了 TSC1在浆液性卵巢癌中低表达的分子机制,为浆液性卵巢癌的诊断和治疗提供了新的靶点。2.明确了 miR-130a促进浆液性卵巢癌发生发展的分子机制,同时发现miR-130a可以作为一种新的自噬抑制剂。3.建立了 NF-κB信号通路与mTOR信号通路之间的联系,从miRNA角度解释了炎症在浆液性卵巢癌发生发展中的作用。本研究的不足之处:1.没有建立miR-130a过表达或者敲除的转基因小鼠。如果可以建立这个动物模型,将极大的丰富我们对于miR-130a的认识。2.本课题所采用的卵巢癌细胞系较古老,有的研究人员认为部分细胞系并不能反应出浆液性卵巢癌的特点。因此,针对高低级别浆液性卵巢,构建新的细胞系具有重大意义。