研究背景：恶性肿瘤是危害人类生命和健康最严重的疾病之一,且其发病率呈逐年上升趋势。据世界卫生组织(WHO)和美国临床肿瘤学会(ASCO)统计,全世界新发生的癌症病人为1000万,死于癌症的病人在600～700万之间,平均占死亡总数的12%。在发达国家居民常见死亡原因中居第一位(占总死亡数的22.3%),发展中国家居第二位(占总死亡数的9.5%)。根据卫生部公布的统计数据资料表明,近年来,我国恶性肿瘤的发病率逐年攀升。2008年,恶性肿瘤在我国城市地区的死亡率已达166.97/10万,占总死因的27.12%。在我国部分城市和农村,恶性肿瘤已经由原本的第三位死亡原因已跃升至第一位,首次成为导致居民死亡的“第一杀手”,超过了分列二三位的脑血管病和心脏病。世界卫生组织在第18届国际抗癌联盟大会上的报告指出：今后20年肿瘤新患者人数将由目前的1000万/年增加到1500万/年,癌症死亡的人数也将由每年600万增至1000万。肿瘤对患者身体上造成的痛苦、给家庭带来的经济负担及对社会造成的破坏是难以估量的。因此,WHO和我国政府已将治疗癌症药物研究列为急需解决的重点课题之一。近年来,世界各国均投入了大量的人力和物力对肿瘤进行研究,研制了许多疗效可靠的药物,如环磷酰胺、5-FU、顺铂等。但由于这些药物毒副作用较大,影响了它们的临床应用。随着回归自然热潮的兴起,从自然界中获得天然的抗肿瘤药物成为研究的热点,已陆续开发出20余种治疗肿瘤的植物药,它们分别为生物碱(如长春碱、喜树碱、三尖杉酯碱等)、木脂素(如鬼臼毒素的半合成衍生物)、柄型大环化合物(如美登木素)、二萜类化合物(如紫杉醇、冬凌草甲素)等。它们大多疗效确切,毒副作用较小。说明从天然植物药中寻找抗肿瘤新药具有巨大的潜力。大量的研究结果已经证实,肿瘤的发生及扩散与人体免疫系统功能的缺失及病变有着极大的关系。此外,抗肿瘤药物对肿瘤的作用也与免疫系统的激发有重要的依赖关系。因此从提高患者免疫功能着手控制肿瘤细胞的生长与扩散,不但对肿瘤会有标靶性的治疗效果,而且能使人体免疫系统得到修复和增强。中药强调提升人体本身的机能以对抗疾病,这与免疫型抗癌的机制十分相近,因此本项目旨在探寻一种通过免疫细胞的抗癌性分化的中草药。尖尾芋为天南星科植物尖尾芋Alocasia cucullata(Lour.)Schott的根茎,该植物广泛分布于我国广东、广西、贵州、云南、四川等省区。为中国植物图谱数据库收录的有毒植物之一,中药名为卜芥,有清热解毒,消肿镇痛功效；用于治疗多种肿瘤、流感、高热不退、钩端螺旋体病、毒蛇咬伤、毒蜂螫伤、慢性支气管炎等。目前对其药用价值关注甚少,多数药用功效只限于民间使用和记载,缺乏系统深入的药理研究,也影响了它的进一步开发和利用。研究目的：本课题对尖尾芋进行水提,在对其成分分析时发现其多糖含量高,故进一步纯化尖尾芋多糖,找出尖尾芋多糖的纯化工艺。然后建立小鼠乳腺癌模型,考察尖尾芋抗肿瘤作用,并考察对黑色素瘤小鼠的生存时间,对正常小鼠的急性毒性作用。最后用细胞模型,证明尖尾芋具有诱导细胞分化作用,并找出与细胞分化的相关细胞因子。本课题研究不仅验证民间用尖尾芋抗肿瘤的科学性,也为从尖尾芋中开发出新型高效低毒、价格适中的天然抗肿瘤药物提供依据。研究方法：1尖尾芋水提物制备及多糖纯化工艺1.1提取：取新鲜尖尾芋根茎,洗净切碎,置于60℃烘箱烤干。粉碎,过筛。称取1000g尖尾芋粉末,沸水提取两次,加水量分别为12mL·g-1,10mL·g-1生药,每次4h,滤过,合并滤液,浓缩至约1000mL,放冷,抽滤。真空冷冻干燥机干燥,得尖尾芋水提粗品,称重,计算收率,备用。1.2多糖的组分分析取尖尾芋提取物,水解后加入固体碳酸钡中和,浓缩。用D-果糖,D-葡萄糖,L-鼠李糖,D-木糖,D-半乳糖做对照品,薄层色谱条件：正丁醇-丙酮-水为展开剂,α-萘酚-硫酸为显色剂,采用硅胶G薄层板做薄层色谱分析,计算硅胶板中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。1.3尖尾芋多糖的初步纯化将尖尾芋粗品溶解于水中,用H202脱色。用胃蛋白酶和Sevage试剂脱蛋白,脱蛋白后的水相置流水透析,透析液浓缩至适当体积,以95%乙醇沉淀,无水乙醚、丙酮反复洗涤,然后用DEAE-52与Sephadex G-200柱层析进一步纯化,冷冻干燥备用。1.4纯度和理化性质测定对纯化后多糖进行纯度鉴定,用考马斯亮蓝测其中蛋白质含量,并测定溶解性等理化性质。2尖尾芋水提物抗小鼠肿瘤作用与急性毒理实验2.1尖尾芋水提物对乳腺癌小鼠的肿瘤抑制作用将70只BALB/c小鼠随机分成七组,每组10只。(1)正常小鼠阴性对照组(N-Nctrl)；(2)模型小鼠阴性对照组(Nctrl)；(3)模型小鼠阳性药物组(Pctrl):(4)模型小鼠低剂量组(A.c-L)；(5)模型小鼠中剂量组(A.c-M)；(6)模型小鼠高剂量组(A.c-H)(7)正常小鼠给药组(N-A.c)。然后取形态良好的指数生长期4T1细胞用于实验。调整细胞浓度为1×107/mL,第一、二、三、四、五各组小鼠右侧腋下皮下注射0.1cm。接种肿瘤细胞一个星期后开始灌胃。第一组灌80mg/mL尖尾芋；第二、六组灌胃160mg/mL尖尾芋；第三组灌胃320mg/mL尖尾芋；第四组灌胃阳性药香菇多糖；第五、七组小鼠蒸馏水灌胃。21天后测量小鼠皮下肿瘤体积,肿瘤重量、脾脏指数与胸腺指数的变化,HE染色观察肿瘤组织的形态改变。ELISA法检测血清内IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1含量,并用MTT法测尖尾芋对正常BALB/c小鼠脾脏细胞、腹腔渗出细胞活力影响。2.2尖尾芋水提物黑色素瘤小鼠的生存时间的影响取18-22g C57BL/6J小鼠20只,随机分为两组,每组10只。将细胞浓度为1×107/mL的B16细胞于各组小鼠右侧腋下皮下注射0.1cm。接种7d后,实验组以160mg/mL尖尾芋灌胃,空白对照组以等体积的蒸馏水灌胃。接种第一天开始计时,持续观察小鼠生存情况,设定观察期限60d,观察荷瘤小鼠生存时间。2.3尖尾芋水提物的急性毒理实验选用昆明种小白鼠40只,雌雄各半,体重20±2g,随机分为对照组和给药组,每组20只。禁食、不禁水12h。一日内分二次给药(8：00,16：00),所有动物给药体积相同,均为40mL/kg体重。给药后小鼠自由进食饮水。药后24h内严密观察受试动物的情况,以后每天观察3次,连续14天,记录各组动物的一般生理指标、行为活动、精神状态及动物存活情况。15天后,颈椎脱臼处死小鼠,解剖,病理检查重要脏器(心、肝、脾、肺、肾),观察尖尾芋的急性毒性作用,并计算小鼠1天内最大给药剂量(g/kg.d)。3尖尾芋水提物诱导单核巨噬细胞分化3.1细胞培养与分化诱导贴壁细胞用细胞刮收集后计数,计算细胞贴壁率和细胞抑制率。其细胞收集用带荧光的CD14与CD11b孵育,多聚甲醛固定。流式细胞仪检测带荧光细胞比例和荧光强度。3.2分化的THP-1细胞周期、相关细胞因子、趋化因子的检测刮取尖尾芋处理的THP-1细胞,PBS漂洗,80%的冰乙醇固定,加PI染色。上流式细胞仪检测各期细胞DNA的含量。离心细胞上清液,按照ELISA试剂盒说明检测其中的TNF-α与IL-1β水平。并使用试剂盒Human Cytokine Array Panel A Array Kit和Human Chemokine Array Kit(R&D Systems)对上清中细胞因子及趋化因子的表达水平进行整体测定。4统计处理用SPSS13.0软件进行统计学处理,所用数据均用x±SD表示,两组间比较采用t检验,多组组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验,方差齐性的组间比较采用LSD检验,方差不齐的组间比较采用Dunnett’s T3检验,小鼠生存期应用Kaplan-Meier法进行统计学检验。p<0.05为有显著性差异。结果：1.尖尾芋水提物的制备和多糖的纯化工艺尖尾芋水提后得到的粗品为249.3g,得率为24.93%。尖尾芋多糖的完全水解液采用薄层色谱分析,结果表明尖尾芋多糖的组成单糖为D-葡萄糖和D-半乳糖。纯化后的尖尾芋多糖为白色固体,易溶于水,不溶于甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂。理化性质实验检测出尖尾芋多糖是非淀粉类多糖,不含游离单糖、多酚类物质、糖醛酸、蛋白质、核酸等物质。2尖尾芋抑制接种肿瘤在体内生长速率尖尾芋高剂量组、阳性对照组、尖尾芋中剂量组、尖尾芋低剂量组、阴性对照组的肿瘤体积大小依次增加,组间效应差别具有统计学意义(F=5.399,P=0.000),各测量时间点肿瘤体积有差异。肿瘤标本HE染色结果显示,阴性对照组瘤细胞生长致密,凋亡细胞少见。而尖尾芋高剂量组和阳性对照组肿细胞较少,排列疏松,细胞轮廓不清晰。在荷瘤小鼠各组血清中,尖尾芋高剂量组与荷瘤小鼠空白对照组比较,IL-2、TNF-α、INF-γ含量均有显著性差异(p<0.01),但TGF-β1含量差异不显著(p=0.075)。正常小鼠各组血清中,尖尾芋组与正常小鼠空白对照组比较,IL-2、TNF-α增高,差异有显著性(p<0.05)。但是IL-10、INF-y与TGF-β1差异不显著(p>0.05)。尖尾芋对体外直接培养的4T1细胞的生长无抑制和促进作用,尖尾芋作用4T1细胞24h后,各组与空白对照组比较差异无显著性。随着时间延长至48h后,各组OD值增加,尖尾芋组与对照组比较,仍无显著性差异。但MTT法测尖尾芋对正常小鼠脾细胞活性,与对照组比较,尖尾芋在浓度为200mg/L的处理组差异无显著性。当浓度为500、1000mg/L的处理组与对照组比较有显著性差异,且随药物浓度增加而增加,呈浓度依赖趋势。尖尾芋对小鼠腹腔渗出细胞增殖有增强作用,与对照组比较有显著性差异。尖尾芋组明显延长小鼠肿瘤生存时间,空白对照组小鼠中位生存期为27(24.98,29.02)天。尖尾芋高剂量组灌胃小鼠生存期为34(30.60,55.39)天,两组小鼠生存期差别有统计学意义(p=0.033)。小鼠急性毒性实验中尖尾芋最大给药量为160.4g/kg.d,相当于人临床日用剂量481.2倍。3尖尾芋诱导THP-1细胞分化THP-1细胞呈现单细胞悬浮状态,仅极少数细胞贴壁。在尖尾芋的培养液中诱导72h后,显示明显的免疫分化。细胞贴于玻璃瓶底部,且不能被含EDTA的胰酶消化。无论分化多长时间,仍然有一定比例的圆形细胞存在。悬浮细胞的数目与尖尾芋浓度成反比,细胞抑制率与浓度成正比。用流式细胞分析尖尾芋诱导THP-1单核细胞向巨噬细胞分化时,CD14与CDllb的表达增高。1000mg/L的尖尾芋作用细胞后,发现流式细胞直方图出现双峰,与前述细胞出现贴壁和悬浮两种形态相符,尖尾芋不能使THP-1细胞全部分化。CDl4与CD11b阳性细胞比例分别为57.40%,39.65%。与对照组比较差异具有显著性(p<0.01),细胞荧光强度显著性增强(p<0.01)。且发现尖尾芋诱导THP-1细胞产生白介素-1β与肿瘤坏死因子-α。流式细胞仪分析细胞周期,浓度为2000,4000mg/L提取物作用THP-1细胞后,sub-G1期细胞比率分别为(22.3±4.1)%和(60.5±0.7)%,与对照组(2.1±1.0)%比较差异均有显著性(p<0.01)。趋化因子芯片实验结果发现,同空白对照比较,尖尾芋组中RANTES表达增强,并且有IL-8、MIP-1α，β、GROα的表达。细胞因子芯片实验结果,尖尾芋组中MIF表达增强,并且有MIP-1α、MIP-1β、IL-8、GRO α、IL-1ra、RANTES、TNF-a的表达。结论：1尖尾芋的水提物中主要为多糖成分。通过脱色,脱蛋白,透析,醇沉,通过柱层析可以将此提取物纯化为一种纯度较高的多糖。急性毒性试验结果表明,尖尾芋提取物在一定浓度下,对小鼠没有急性毒性作用。2研究发现虽然尖尾芋对肿瘤细胞的直接抑制和杀伤作用相对较弱,但能抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,这种作用是由于尖尾芋能增强脾细胞,腹腔巨噬细胞的活力,提高血清中,IL-2、TNF-α、INF-γ等免疫因子。除此之外,也能延长黑色素瘤小鼠的生存期。说明尖尾芋提取物通过非特异性地激发和增强机体的免疫功能,使机体产生抗肿瘤免疫应答,从而控制和杀灭肿瘤细胞。3尖尾芋水提物对THP-1细胞有分化作用,主要体现在诱导细胞产生TNF-a与IL-1β等免疫相关因子,使细胞阻滞在sub-G1期。