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牛肉富含蛋白质,铁,锌,维生素B和必需的多不饱和脂肪酸,是人类高品质营养的来源。随着现代生活水平的提高和健康消费意识的增强,我国的消费者对牛肉的数量和品质的需求也呈逐年递增趋势。肉质性状是一个复杂经济性状,大量基因参与调控肉质性状的形成过程,但目前牛肉品质遗传标记和相关功能基因的信息非常有限,严重阻碍我国肉牛优良品种选育和新品种培育进程,因此遗传标记筛查、功能基因挖掘及基因网络调控和作用机理的研究是我国优质、高效肉牛品种培育过程中必须突破的分子基础理论和技术的关键。本研究针对目前我国肉牛研究领域中功能基因较少等突出问题,以肉质性状和肌间脂肪沉积能力存在显著差异的日本和牛与草原红牛为研究对象,采用全基因组DNA甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)和RNA-seq对两个品种牛背最长肌DNA甲基化和转录组进行分析,筛选牛肉质性状相关候选基因和候选区域,并对部分候选基因和候选区域进行了功能验证和作用机制分析。甲基化分析结果显示,日本和牛与草原红牛背最长肌之间,8596个基因中存在差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs),差异甲基化基因(Differentially methylated genes,DMGs)显著富集在1046个GO terms(p<0.05),DMGs富集在276个KEGG信号通路中,但无信号通路显著富集(p>0.05)。亚硫酸氢钠处理测序法(BSP)的方法验证了部分DMRs的甲基化水平,结果与测序结果趋势一致。RNA-seq分析结果显示,日本和牛与草原红牛背最长肌之间存在388个表达量差异基因(Differentially expressed genes,DEGs)(Log2FC>0.585或<-0.585,FDR<0.05),其中,205个基因在日本和牛的表达水平高于草原红牛(p<0.05),183个基因在日本和牛的表达水平低于草原红牛(p<0.05)。差异基因显著富集在475个GO terms(p<0.05);KEGG分析显示,下调基因显著富集在20个通路中(p<0.05),上调基因显著富集在7个通路中(p<0.05),荧光定量PCR和Western Blot的方法分别验证了部分DEGs的m RNA和蛋白的表达量,结果与测序结果一致。全基因组甲基化与转录组联合分析结果显示,共有331个DMRs与DEGs呈现负相关,其中21个DMRs位于DEGs的启动子区,在牛和猪的4个群体中,对6个负相关基因启动子区序列的CG岛分布情况和遗传多态性进行了分析和转录因子结合位点预测,为进一步研究启动子DNA甲基化对肉质性状调控的机制奠定了基础。为进一步验证候选基因对脂肪生成和脂肪酸代谢的作用及调控机制,本研究利用基因过表达技术,在牛胎儿成纤维细胞中验证了HSL,CD44,KLF5,CRYAB,ANKRD2,ALDH9A1,EHHADH对细胞内甘油三酯和脂肪酸含量的影响,并利用q PCR array分析和STRING预测了以上7个基因的表达水平对脂肪和脂肪酸代谢通路相关基因的调控作用,结果表明HSL,CD44,KLF5过表达导致牛胎儿成纤维细胞内甘油三酯含量显著增加(p<0.05),而CRYAB,ANKRD2,ALDH9A1,EHHADH过表达导致细胞内甘油三酯含量显著减少(p<0.05)。脂肪酸含量检测分析发现,HSL过表达导致细胞内己酸、辛酸、棕榈酸、硬脂酸以及总脂肪酸含量增加,亚油酸和顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸含量降低(p>0.05);过表达CRYAB导致己酸含量升高,但辛酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸的含量以及总的脂肪酸含量低于对照组(p>0.05);过表达ANKRD2的细胞内检测的各脂肪酸成分以及总的脂肪酸降低(p>0.05);ALDH9A1,CD44和KLF5过表达导致细胞内各类脂肪酸含量和总脂肪酸含量均增加,但以上基因的过表达组与对照组相比,细胞内各类脂肪酸含量和总脂肪酸含量差异均不显著(p>0.05)。q PCR array检测脂肪和脂肪酸相关基因表达水平显示,HSL过表达导致CPT1C,FABP2,BDH2,PECR,PRKAB2,EHHADH表达量上调(FC>1.5,p<0.05);CD44过表达导致HMGCS2和CPT1C基因表达量上调(FC>1.5,p<0.05),EHHADH,FABP4,GK2,HSL基因表达量下调(FC<1/1.5,p<0.05);KLF5过表达导致HMGCS2基因表达量上调(FC>1.5,p<0.05),ACOT12,ACOT6,ACSBG2等12个基因表达水平下调(FC<1/1.5,p<0.05);CRYAB过表达导致GPD1基因表达量上调(FC>1.5,p<0.05),ACSL6,MCEE,PRKAG1基因表达水平下调(FC<1/1.5,p<0.05);ANKRD2过表达导致HMGCS2,MUT基因表达量上调(FC>1.5,p<0.05),GK2基因表达水平下调(FC<1/1.5,p<0.05);ALDH9A1过表达,导致HMGCS2,FABP5,SLC27A1,ACADSB,ACAD11,MUT,FABP4,CRAT,PECR,ACSL5基因表达水平上调(FC>1.5,p<0.05),HSL基因表达水平下调(FC<1/1.5,p<0.05);EHHADH过表达导致ACAA1,ACAD10,ACAD11,ACADM,ACADS,ACADSB等33个基因表达水平下调(FC<1/1.5,p<0.05)。此外,蛋白相互作用预测结果显示,CD44,KLF5,CRYAB和ANKRD2与脂肪和脂肪酸代谢通路中表达水平上调和下调的基因不存在蛋白间互作关系,而HSL,ALDH9A1,EHHADH基因与部分基因存在相互作用。本研究获得了日本和牛与草原红牛之间存在的大量DMRs和DEGs,系统筛选和挖掘决定肉牛肌肉生长、脂肪沉积等肉质性状的关键候选基因,通过不同物种间基因序列比对以及CG岛预测和遗传多态性检测,分析和预测了SNPs位点对基因启动子序列甲基化水平,转录因子结合位点和候选基因表达可能存在的调控作用,在细胞水平上,采用基因过表达,验证了候选基因对脂肪和脂肪酸代谢的功能,全面解析候选基因对细胞内脂肪含量和脂肪酸含量的影响,以及对脂肪和脂肪酸代谢的调控机制。为进一步挖掘与肉质性状相关的功能基因和完善脂肪代谢调控网络奠定理论基础。此外,获得具有重要育种价值的功能基因和调控元件,将为转基因肉牛新品种培育及其产业化提供基因资源和技术支撑。