论文部分内容阅读
研究背景:结核病仍然是世界所面临的主要卫生问题,全球约有二十亿人感染了结核分枝杆菌。我国的结核病疫情在全球属高流行地区,根据2000年全国结核病流行病学抽样调查显示,我国结核病疫情主要有以下特点:1)患病率高,活动性肺结核患病率为367/10万,涂阳患病率为122/10万;2)耐药率高,初始耐药率为18.6%,获得性耐药率为46.5%;3)全人口感染率高,为44.5%,我国约有5.5亿人感染了结核杆菌。结核病的治疗和预防面临严峻的考验。因此,研究新的、有效的防治策略控制结核病迫在眉睫。结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌,结核分枝杆菌感染巨噬细胞后,可在宿主细胞内繁殖,裂解细胞或处于潜伏状态。IFN-γ是机体抵抗细胞内致病菌关键的细胞因子,由CD4+和CD8+的T淋巴细胞及NK细胞产生。IFN-γ是一种重要的巨噬细胞启动因子,IFN-γ活化巨噬细胞,启动巨噬细胞的氧依赖性和氧非依赖性杀菌系统,使巨噬细胞获得杀灭细胞内寄生菌的能力,同时其抗原递呈能力进一步加强,使机体扩大抗结核的免疫效能。IFN-γ基因的转录由IFN-γ近端启动子区(-73 bp ~ -48 bp)调控,特异的蛋白与启动子区结合将调节启动子的活性和IFN-γ的分泌。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB),是一种真核细胞转录因子,与IFN-γ近端启动子区结合,调节IFN-γ基因的转录。CREB蛋白的磷酸化会促进这种结合。目前,针对IFN-γ转录调控机制的研究刚刚起步,尚不清楚CREB蛋白在IFN-γ转录分泌调节中的作用,CREB蛋白在机体对结核菌的保护性免疫中的作用有待进一步阐明。对CREB蛋白在IFN-γ的转录、分泌调节中作用的研究,将为利用CREB蛋白防治结核病提供实验依据。研究目的:通过CREB蛋白与IFN-γ近端启动子区结合的研究,探讨CREB蛋白对IFN-γ转录的调节作用;比较结核病患者和PPD阳性健康对照人群血液中CREB蛋白及磷酸化的CREB蛋白表达水平的差异,探讨CREB蛋白在结核病免疫调节中的作用,明确CREB蛋白作为新药开发和疫苗研制分子靶位的可行性。研究方法:第一部分:选取25例初治涂阳肺结核患者和18例PPD阳性健康人作为研究对象,留取静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC),利用磁性激活细胞分离技术(MACS)阳性分选得到CD3+T细胞,流式细胞仪检测CD3+T细胞的纯度;从CD3+T细胞提取核蛋白后,采用凝胶电泳迁移率变化分析(EMSA)研究CREB蛋白能否和IFN-γ的近端启动子结合;采用超迁移率(supershift)变化分析实验验证低迁移率条带的DNA-蛋白质复合物的特异性。Western blotting检测结核病患者和PPD阳性健康对照者CREB蛋白表达水平的差异。第二部分:选取25例初治肺结核患者和18例PPD阳性健康人作为研究对象,留取血标本,分离外周血单个核细胞(PBMC);利用磁性激活细胞分离技术(MACS)阳性分选得到CD3+T细胞,流式细胞仪检测CD3+T细胞的纯度;加入通过热灭活方法制备的结核分枝杆菌抗原, RPMI1640培养24小时;利用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术研究在体内状态下,结核分枝杆菌抗原刺激CD3+T细胞能否诱导CREB蛋白产生并和IFN-γ近端启动子的结合;并采用Western blotting研究结核分枝杆菌抗原能否诱导CREB蛋白磷酸化。研究结果第一部分:在25例初治肺结核患者中有18例的EMSA结果相比于18例PPD阳性健康人的结果缺失一条低迁移率的条带,说明结核患者缺少和IFN-γ的近端启动子结合的蛋白;超迁移率变化分析实验证明蛋白质-DNA复合物的特异性,结果证明核蛋白特异性的与IFN-γ近端启动子结合,并且蛋白质内含有CREB蛋白;Western blotting结果显示结核患者的CREB蛋白表达水平与PPD阳性健康对照者相比显著降低。第二部分:10例PPD阳性健康对照者ChIP实验PCR产物电泳图都有一条204bp条带,证实PPD阳性健康人活体T细胞在结核分枝杆菌抗原刺激时诱导产生CREB蛋白并与IFN-γ的近端启动子结合。12例结核病患者的电泳图204bp条带缺失,显示缺少与IFN-γ的近端启动子结合的CREB蛋白,表明在体内条件下肺结核患者CD3+T细胞产生CREB蛋白的能力下降;而且,Western blotting结果显示肺结核患者CD3+T细胞在结核分枝杆菌抗原刺激时不能诱导磷酸化CREB蛋白的产生。研究结论:1. CREB蛋白和IFN-γ的近端启动子结合,调控IFN-γ的转录、分泌。2.结核病患者的CREB蛋白表达水平降低,并且活体T细胞在结核分枝杆菌抗原刺激时不能诱导产生磷酸化的CREB蛋白,导致与IFN-γ的近端启动子结合的CREB蛋白减少, IFN-γ的近端启动子的活性下降,限制IFN-γ的转录,下调IFN-γ的分泌。3. CREB蛋白是一种保护性蛋白,促进IFN-γ的转录和分泌,有助于机体对结核分枝杆菌的保护性免疫反应。