类风湿关节炎（RA）是一种常见的自身免疫性疾病。以滑膜细胞的异常增生、破骨细胞不规则分化以及炎症因子释放为主要特征。血管紧张素（AngⅡ）是血管紧张素原经过血管紧张素转化酶（ACE）催化后的产物。血管紧张素的受体包括1型受体（AT1R）和2型受体（AT2R）。AngⅡ与两种受体有着相似的亲和力。AngⅡ作用于AT1R发挥着收缩血管、促炎、促纤维化以及促进机体氧化应激的作用;激动AT2R产生与AT1R相反的生理作用,如舒张血管、抗炎、抗纤维化和抗氧化应激的作用。树突状细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞等炎症免疫细胞均拥有独立的肾素血管紧张素系统（RAS）。因此血管紧张素受体对炎症免疫细胞有着强大的调控作用。AngⅡ以自分泌或旁分泌的形式作用于炎症免疫细胞上的AT1R参与炎症免疫反应。研究证实,AT1R在RA等自身免疫病中发挥重要作用。使用血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂（ARBs）后可以缓解RA及其动物模型的滑膜炎,兼具改善RA患者异常的心血管功能。阻断AT1R后机体内游离的AngⅡ会大量作用于AT2R,激活AT2R下游信号通路继而发挥AT2R的保护性功能也是ARBs类药物治疗RA重要药理作用之一。滑膜巨噬细胞（SM）能够吞噬关节腔中的异物,还能作为如成纤维样滑膜细胞（FLS）,T细胞和B细胞所分泌细胞因子的靶细胞,促进自身产生多种促炎性细胞因子和趋化因子如TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-6等参与RA致病过程。巨噬细胞在不同因素诱导下具有不同的表型和功能,即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。在RA疾病发展的不同阶段中M1/M2型巨噬细胞的比例不尽相同,存在数量和比例失衡。在RA的活动期促炎的M1型巨噬细胞不断增多,促进炎症消退及组织修复的M2型巨噬细胞比例减少从而加剧炎症反应。AT1R/AT2R失平衡是否促进异常活化SM的M1型极化进而参与RA滑膜炎?激动AT2R及其信号能否抑制SM的异常活化和功能?目前不清楚。前期研究表明,通过关节腔注射AT2R激动剂CGP42112可以改善佐剂性关节炎（AA）大鼠关节滑膜炎症,抑制滑膜细胞增殖。激动AT2R可以缓解炎症免疫反应,提示AT2R可能成为治疗RA的新靶点。本项目利用大鼠胶原性关节炎模型（CIA）和RA患者滑膜组织,采用免疫荧光、免疫组化、免疫印迹,流式细胞术及AT2R工具药等实验方法和试剂,研究RA的巨噬细胞活化、功能变化;探讨AT2R信号转导及与MAPKs交叉对话对巨噬细胞活化、功能的作用。为揭示血管紧张素受体信号对RA异常活化巨噬细胞的调节作用以及为AT2R作为RA滑膜炎治疗靶点提供实验依据。目的:探讨AT1R/AT2R信号转导失平衡与RA的巨噬细胞异常活化之间的关系。明确通过抑制GRK2转膜,下调MAPKs-NF-κB是激动AT2R抑制巨噬细胞活化的机制之一。方法:1.收取对照者和RA患者滑膜组织,用HE染色观察RA滑膜病理特征。用免疫组化检测巨噬细胞分布情况。组织免疫荧光观察AT1R和AT2R受体、M1型巨噬细胞标记iNOS、M2型巨噬细胞标记TGM2以及GRK2在巨噬细胞上的表达。收集15位健康志愿者和32例RA患者外周单个核细胞（PBMCs）,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测PBMCs中AT1R和AT2R水平。分析人PBMCs中AT1R和AT2R蛋白表达与RA临床指标的相关性。2.使用鸡Ⅱ型胶原诱导建立大鼠CIA模型,采用关节腔注射AT2R激动剂CGP42112（5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg）,足爪仪测量继发侧足爪容积、记录足爪肿胀数、H&E染色观察关节病理、Luminex液相芯片检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和MIP-2水平、流式细胞术检测大鼠滑膜组织单细胞悬液中AT1R和AT2R以及巨噬细胞分型标志物CD86和CD163的表达。3.用格里斯试剂盒检测不同浓度AT2R激动剂和AT2R拮抗剂对骨髓巨噬细胞（BMDM）上清中NO含量的影响,探索最适给药浓度。Luminex液相芯片分别检测AT2R激动剂处理不同时间后对BMDM上清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP-2含量的影响;使用FITC-Dextran检测骨髓巨噬细胞的吞噬能力。Western blot检测AT2R激动剂对MAPK通路的影响。分别用流式细胞术和western blot检测胞膜和胞质上GRK2的表达,用Co-IP检测GRK2和p-ERK的共表达。提取核蛋白,检测核转录因子P65和P50的入核情况。结果:1.与对照组滑膜相比,病理检测结果显示RA病人滑膜显著增生,滑膜中血管翳显著增多。免疫组化显示,RA患者滑膜中巨噬细胞数量显著增多,大量分布在RA病人滑膜内层,紧贴关节腔。免疫荧光双染结果显示在RA患者SM上AT1R、AT2R、iNOS和Arg1表达均显著升高。与健康志愿者相比,RA患者PBMCs上AT1R和AT2R的水平显著增高。相关性分析结果表明PBMCs中AT1R蛋白表达和AT1R/AT2R与C反应蛋白（CRP）和血沉（ESR）呈正相关;而AT2R蛋白表达CRP和ESR呈负相关。2.激动AT2R对大鼠类风湿关节炎具有治疗作用。与对照组相比,CIA组大鼠继发侧足爪容积、肿胀数显著升高,体重明显低于正常组;与CIA组相比,CGP42112组大鼠继发侧关节炎症状明显降低。组织病理学结果表明,与CIA组大鼠相比CGP42112组大鼠滑膜细胞增生、炎细胞的浸润和血管翳的数量,以及软骨和骨的侵蚀均显著减轻。CGP42112组SM上AT1R表达减少,AT2R表达升高;M2型巨噬细胞比例高于CIA组。3.CGP42112(10^-6M)能显著下调BMDM中AT1R的表达,上调AT2R的表达,抑制LPS介导的M1型极化。给予CGP4112后能够抑制ERK磷酸化对P38和JNK磷酸化没有影响。AT2R激动剂CGP42112能够减弱巨噬细胞吞噬能力,抑制GRK2的转膜,促进胞质中的GRK2与p-ERK结合进而抑制p-ERK对NF-κB的活化。结论:1.RA病人滑膜组织和PBMCs中AT1R和AT2R的表达显著升高,且SM以M1型巨噬细胞为主,AT1R/AT2R失平衡可能参与了巨噬细胞M1型极化。2.关节腔注射CGP42112改善CIA大鼠继发关节滑膜炎症状,降低血清中炎症细胞因子,降低大鼠SM上AT1R/AT2R的比值,同时抑制SM向M1型极化。提示激动AT2R可以通过逆转AT1R/AT2R失平衡,促进巨噬细胞向抑炎M2型极化。3.AT2R及其信号能够抑制RA的巨噬细胞的异常活化,该作用与激动AT2R从而抑制GRK2转膜、下调p-ERK-NF-κB信号途径有关。