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右旋糖酐是一种由若干葡萄糖脱水形成的高分子聚合物,是世界上第一个工业化生产的微生物多糖,在医药、食品和石油等方面都有着广泛的应用。本文以氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶为主要研究对象,通过建立表达调控策略,诱导胞内右旋糖酐糊精酶高表达。对以淀粉衍生物-麦芽糊精为底物酶法合成的产物进行了结构分析及鉴定,确定其为一种新型的右旋糖酐,同时也证明了该酶源为右旋糖酐糊精酶；在此基础上,应用蛋白纯化技术获得了电泳纯的新型右旋糖酐糊精酶并对其催化性质进行了研究。主要研究内容包括：
⑴采用细胞透性化技术建立了胞内右旋糖酐糊精酶的快速提取、检测技术。细胞透性化技术使胞内酶在稳定的细胞内环境中发挥作用,从而提高其稳定性和催化效率。正交试验设计确定的最佳提取方法为:甘氨酸质量分数15％,Triton X-100体积分数1％,菌悬液OD600=0.5.6.0,pH6.8,冰浴处理时间为1h。
⑵利用Plackett-Burman Design设计和Response Surface Methodology设计对氧化葡萄糖杆菌合成右旋糖酐糊精酶的产酶培养基进行了优化,最终确定的最优配方为:葡萄糖17.67g/L,麦芽糖30g/L,胰蛋白胨12.20g/L,酵母粉13.53 g/L,硝酸铵15g/L,硫酸铜0.01g/L,硫酸锌0.01 g/L,氯化钠0.01g/L,初始pH6.0。优化后,酶活由初始的0.04U/mL提高到0.24U/mL,达到目前文献报道的最大值。
⑶为进一步提高氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶的产量,在3L发酵罐水平上考察了pH(3.5-6.0)对菌体生长和产酶的影响。基于不同pH发酵过程中菌体生长及产物合成的变化,确定了pH两阶段控制策略,即0-6h时控制pH5.0,6h后将pH调至4.0。通过采用这一优化策略,发酵液中右旋糖酐糊精酶单位体积酶活有了较大的提高,高达4.03U/mL。
⑷研究了氧化葡萄糖杆菌利用麦芽糊精合成右旋糖酐的过程并对产物结构进行了分析。凝胶渗透色谱分析表明产物的分子量为96.8kDa,并应用气相色谱.质谱联用技术、红外色谱法、核磁共振波谱法和甲基化分析对产物结构进行了分析。结构分析说明产物右旋糖酐仅仅是由葡萄糖单元聚合而成的,其非还原端葡萄糖单元:6位连接葡萄糖单元:4,6位连接葡萄糖单元=8.62:78.79:12.59。这一结果说明,产物右旋糖酐中主链为α-1,6-糖苷键,同时少量的α-1,4-糖苷键仅出现在支链中。这种结构与已报道的右旋糖酐均存在一定的差异,是一种新型的右旋糖酐。同时这也说明G.oxydans DSM2003胞内含有以糊精为底物合成右旋糖酐的右旋糖酐糊精酶。
⑸联合应用离子交换层析和凝胶过滤层析法纯化得到了电泳纯的右旋糖酐糊精酶,同时考察了其主要的酶学特性:分子量,62kD；最适温度,35℃；最适pH,pH6.3。这些性质均与已报道的氧化葡萄糖杆菌ATCC11894右旋糖酐糊精酶存在较大差异,因此我们通过纯化得到的是一种新的酶源。
⑹应用分子克隆技术表达了来源于氧化葡萄糖杆菌的糖基转移酶编码基因GOX1482、GOX0939和来源于季也蒙毕赤酵母的预测基因PGUG_05731。酶活性分析发现,基因GOX1482、GOX0939的诱导表达产物不具备葡萄糖基转移酶活性,而预测蛋白PGUG05731则是一种麦芽糊精葡萄糖基转移酶。