背景:肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性实体瘤之一。2018年全球致死性慢性非传染性疾病中,因肿瘤死亡患者多达955万[20],其中肝细胞性肝癌的致死率高居第四位。乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)的感染、过量摄入黄曲霉毒素等是HCC发生的高危因素之一。近年来研究发现,肥胖和II型糖尿病等代谢性疾病与多种肿瘤的发生密切相关,临床流行病学证据也表明,上述代谢性疾病与HCC的发生相关[1–4]。由于肝癌恶性程度较高、较早发生转移,5年总体平均生存率低于30%。因此,对HCC的发生发展机制进行深入的研究,将为肝癌的诊断和治疗提供理论依据以及新的治疗策略。随着代谢组学研究的进一步深入,发现肿瘤组织发生“代谢重编程”,即在营养摄取和代谢消耗间达到新的平衡,以同时满足肿瘤细胞生物大分子合成和ATP供能的需要。绝大多数肿瘤细胞糖代谢的特点是:即使在氧气充足的条件下,肿瘤细胞也优先通过糖酵解途径消耗葡萄糖供给能量(也被称为“Wargburg”效应),上述糖代谢的改变对于满足肿瘤细胞快速生长、增殖以及代谢需求至关重要。糖异生(Gluconeogenesis)是糖代谢的一个重要的部分,是非糖的前体物质(如丙酮酸、乳酸和甘油等)合成葡萄糖或糖原的过程。禁食条件下糖异生主要发生在肝脏,约占糖异生总量的90%。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)是糖异生反应的第一个关键酶,其能够催化草酰乙酸(OAA)生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)并消耗1分子GTP。已知有两种PCK的单体形式,即细胞质同种型(PCK1,PEPCK-C)和线粒体同种型(PCK2,PEPCK-M)。在哺乳动物肝脏中,95%以上发挥酶活性的单体形式为PCK1(见图1)。目前在多种肿瘤组织中发现PCK1的表达异常:Montal[5]等学者报道PCK1在结直肠癌中表达上调,能够进一步增加葡萄糖消耗,支持细胞的合成代谢从而促进肿瘤细胞的生长;黄波教授团队在黑色素瘤干细胞中发现PCK1呈高表达,并且能够催化肿瘤干细胞糖代谢的逆向流动,促进更多的中间产物合成以满足其旺盛的代谢需求[6,7];Ruihua Ma等学者研究发现,在肝癌组织中PCK1低表达,糖皮质激素地塞米松通过上调PCK1的表达,促进糖异生作用而抑制HCC细胞增殖[8,9]。PCK1在不同类型肿瘤的发生发展过程中发挥了不同的作用,其在HCC发生发展中的具体作用尚未完全清楚[10]。代谢组学相关研究已证实,肿瘤组织中葡萄糖水平通常均低于正常组织中的葡萄糖水平3到10倍不等[11,12]。然而,肿瘤细胞需要足够的葡萄糖产生组成细胞基本成分所必需的结构单元,从而促进肿瘤的快速生长[13]。因此,肿瘤细胞需要精细的能量感知和代谢适应的途径。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是以腺嘌呤核苷酸为中心的细胞传感器,在感知细胞能量的可用性和调节代谢适应通路中起关键作用[14]。肿瘤组织中的能量应激状态通常表现为细胞内AMP/ATP比率改变,能够由AMPK感知(图2)。AMPK一旦被激活,磷酸化的AMPK能够通过增加分解代谢中的ATP生成过程(例如糖酵解和脂肪酸氧化),同时减少ATP消耗过程(例如脂肪酸合成和细胞增殖)来恢复细胞内能量平衡[15,16]。活化后的AMPK还能够通过对细胞内信号通路的调控(例如p27Kip1[17,18]),从而调节细胞周期进程抑制细胞增殖。本课题首先观察了糖异生关键酶PCK1在临床肝癌组织标本、肝癌细胞系中的表达情况,通过体内外实验证实PCK1过表达对肝癌增殖的抑制作用,并进一步研究其抑制肝癌增殖的具体机制。上述实验将有助于我们深入了解PCK1在肝癌发生发展中的作用,从肿瘤代谢的全新角度去揭示肿瘤细胞通过感知营养状态并调控基因表达和肿瘤生长的新机制,发现肿瘤代谢的异常靶点和关键环节,有望为临床肝癌的防治提供新的思路和策略。实验方法:1、通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析临床肝癌组织与癌旁组织中PCK1表达情况,分析PCK1表达量与患者预后之间的关系。采用q RT-PCR,Western blot和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)方法检测PCK1在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。2、通过体外细胞实验观察PCK1对肝癌细胞增殖能力以及细胞周期的影响:利用Ad Easy腺病毒载体系统构建过表达PCK1重组腺病毒表达载体,并获得过表达PCK1的肝癌细胞模型;利用CRISPR/Cas9技术构建了PCK1基因特异性敲除的肝癌细胞模型。通过MTS实验、克隆形成实验,检测PCK1对肝癌细胞增殖能力的影响;通过细胞流式学分析,观察PCK1对肝癌细胞细胞周期的调控作用。在肝癌荷瘤裸鼠模型进一步验证PCK1对肝癌增殖的调控。3、检测PCK1引起的AMPK激活对RB/E2F信号通路的调控:(1)对过表达PCK1和GFP的肝癌细胞进行转录组测序,筛选、富集、分析RB/E2F信号通路。采用q RT-PCR和Western blot验证PCK1对RB/E2F信号通路分子的调控。(2)采用Western blot分析不同培养时间以及不同葡萄糖浓度培养条件下,PCK1过表达和PCK1基因敲除肝癌细胞中细胞能量感受器AMPK及p AMPK表达水平。(3)Western blot及ATP检测试剂盒检测AMPK上游分子的改变,明确AMPK激活的分子机制;(4)在PCK1过表达的肝癌细胞系中转染sh AMPK,或者用AMPK激动剂Metformin处理PLC/PRF/5PCK1-/-细胞,Western blot、细胞流式分析以及克隆形成实验验证PCK1通过AMPK调控细胞周期及肝癌细胞增殖中起到关键作用。4、在裸鼠皮下及原位成瘤组织标本及人组织标本中验证PCK1通过激活AMPK调控下游基因的表达。运用数据库分析、Western blot、q RT-PCR以及IHC方法在肝癌组织中进一步验证PCK1和p AMPK表达量的相关性以及对下游RB/E2F信号通路相关分子表达量的影响。5、在肝癌细胞系中验证PCK1调控Nrf2信号通路及氧化应激。通过NADPH/NADP+试剂盒、ROS检测验证PCK1对细胞能量环境及氧化应激的改变;通过Western blot、转录组测序以及q RT-PCR检测PCK1调控ROS水平对Nrf2信号通路以及下游分子TXNRD1的调控作用。在裸鼠皮下和原位肝癌组织标本中验证PCK1过表达对ROS以及TXNRD1的调控作用。6、TXNRD1抑制剂Auranofin增强Sorafenib抗肝癌疗效的实验观察:采用TXNRD1的特异性抑制剂Auranofin与Sorafenib联用,处理PCK1敲除的肝癌细胞,验证Auranofin能否增强Sorafenib对PCK1表达缺失细胞的致凋亡效应。结果:1、TCGA数据库分析发现,肝癌组织中PCK1的表达明显低于癌旁组织(P<0.01);并且低表达PCK1的HCC患者生存期显著低于高表达PCK1的患者。Western blot结果发现有31/40对标本肿瘤组织PCK1蛋白表达呈下调趋势,占77.5%,q RT-PCR检测发现肿瘤组织PCK1 m RNA表达也明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.01)。免疫组化分析结果也证实了这一趋势。2、过表达PCK1明显抑制肝癌细胞增殖能力,肝癌细胞周期阻滞于G1期;而敲除PCK1能够提高肝癌细胞增殖能力,促进肝癌细胞由G1到S期的转换。裸鼠皮下成瘤实验结果提示过表达PCK1的肿瘤生长速度和重量明显低于对照组。3、通过RNA-Seq筛选到PCK1过表达后RB/E2F信号通路中多个分子发生改变。Real-time PCR和Western blot证实了PCK1过表达下调Cyclin E1,E2F2,p RB以及p CDK2的表达,上调p27表达;PCK1敲除细胞中细胞表型与过表达相关。说明PCK1通过调控CDK/Rb/E2F信号通路,阻滞了肿瘤细胞G1到S期的转换,抑制细胞增殖。在连续培养5天以及低糖处理(1mmol/L葡萄糖)的条件下,过表达PCK1可显著增强AMPK的磷酸化,而PCK1敲除细胞p AMPK水平明显下调。在低糖培养条件下,PCK1过表达细胞ATP水平显著下调。说明PCK1通过调控ATP水平,从而激活AMPK分子。在PCK1过表达的肝癌细胞系中敲低AMPK(sh AMPK)表达,p AMPK及p27蛋白水平下调,p RB表达水平上调,肿瘤细胞G1到S期转换增多,促进细胞增殖;Metformin处理PCK1敲除肝癌细胞系,p AMPK及p27蛋白水平上升,p RB表达水平下降,细胞阻滞在G1期,肿瘤细胞增殖能力也受到抑制。4、裸鼠皮下成瘤实验结果显示PCK1过表达组肿瘤生长速度和重量明显低于对照组,肿瘤组织中p AMPK及p27蛋白水平上升。裸鼠原位成瘤实验结果提示PCK1敲除后肿瘤的增长能力进一步提升,而二甲双胍能够抑制肿瘤的增长。5、通过对TCGA数据库内HCC标本进行分析,发现PCK1表达水平与p27呈正相关,与Cyclin E1呈负相关。通过Western blot分析临床肝癌组织,PCK1、p AMPK及p27蛋白水平在肿瘤组织水平均低于癌旁组织。通过免疫组化也进一步验证了:与癌旁组织相比,PCK1及p AMPK在肿瘤组织中低表达。6、另外,通过NADPH/NADP+检测以及ROS染色分析发现,PCK1能够增加NADPH水平从而减少ROS的产生,敲除PCK1能够起到类似的作用;Western blot实验证实了PCK1能够抑制Nrf2的核转位以及下游靶分子TXNRD1的表达。体内实验也证实了PCK1能够减少ROS的产生以及TXNRD1的表达。通过Western blot以及荧光检测可发现Auranofin与Sorafenib联用,能够增强Sorafenib诱导的PCK1敲除肝癌细胞的凋亡水平。结论:在本研究中,我们首先证实了PCK1在肝癌组织的表达明显低于癌旁组织,体内外实验中均证明PCK1可降低肝癌细胞ROS水平,抑制细胞周期G1/S期转换和肝癌细胞的增殖能力。研究其机制发现:一方面,在葡萄糖饥饿的情况下,PCK1过表达能够通过降低细胞内ATP水平,增加AMPK的磷酸化和p27的表达,从而抑制CDK/RB/E2F信号通路,导致细胞周期阻滞在G1期,抑制细胞增殖。而AMPK的激动剂二甲双胍能够显著逆转这一作用。另一方面,敲除PCK1能够通过代谢途径抑制NADPH的水平,从而上调ROS水平,激活Nrf2信号通路以及促进下游靶分子TXNRD1的表达,而TXNRD1的特异性抑制剂Auranofin能够协同增强Sorafenib对PCK1敲除细胞中的致凋亡作用。本课题阐释了PCK1通过调控AMPK/p27轴以及Nrf2信号通路抑制肝癌细胞增殖的具体分子机制,并初步探讨了二甲双胍和Auranofin对HCC潜在的治疗作用。