论文部分内容阅读
目的：应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)检测人类乳腺癌ERα阴性细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435ER α基因5’端核心启动子区CpG岛甲基化情况，探索ERα基因表达沉默是否与其基因核心启动子区CpG岛甲基化有关；观察肼苯哒嗪能否作为去甲基化药物诱导ERα基因表达，恢复ERα阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性，并进一步探讨肼苯哒嗪联合他莫昔芬对ERα阴性乳腺癌细胞抑制作用，为ERα阴性乳腺癌开辟新的内分泌治疗途径提供实验依据。 方法：(1)利用MSP检测ERα阴性MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌细胞ERα基因5’端核心启动子区CpG岛甲基化状态；(2)不同浓度肼苯哒嗪处理上述两种乳腺癌细胞，RT-PCR检测ERα和maspin mRNA表达情况；(3)将上述两种细胞各分为四组，分别为肼苯哒嗪和他莫昔芬单药作用组、联合用药组、对照组，MTT检测各组细胞生长情况，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，电镜观察细胞超微结构的变化。 结果：(1)MSP检测结果表明ERα阴性MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌细胞ERα基因5’端核心启动子区存在CpG岛甲基化；(2)肼苯哒嗪处理ERα阴性乳腺癌细胞后，RT-PCR检测到ERα和maspin mRNA表达；(3)MTT测定表明，当肼苯哒嗪浓度≥10μM时能抑制MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌细胞生长，与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)，而10μM组与20、40、80μM组间无显著性差异(P＞0.05)。肼苯哒嗪对这两种细胞抑制率随时间增加而逐渐升高，当肼苯哒嗪作用时间超过48小时，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，即呈时间依赖关系；与对照组、肼苯哒嗪和他莫昔芬组比较，联合用药组作用24小时后即能显著抑制细胞生长(P＜0.01)。流式细胞仪分析发现：MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞接受肼苯哒嗪作用72小时后出现G0／G1期周期阻滞，S和G2期细胞较对照组明显减少，肼苯哒嗪(10μM)诱导MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞凋亡率分别为8.71％和11.20％(P＜0.05)。而与对照组和肼苯哒嗪组比较，联合用药组能显著阻滞细胞周期于G0／G1期，细胞凋亡率分别为48.8％和53.1％(P＜0.01)。光镜和电镜观察发现：对照组和他莫昔芬组细胞形态第三军医大学硕士学位论文较好，腆苯哒嗦作用组变性细胞多见，细胞表面微绒毛少见，线粒体肿胀、峭扩张，形成自噬溶酶体，可见髓鞘样变，粗面内质网扩张等。联合用药组主要表现为坏死细胞多见，细胞碎片多，形态不规则，胞质内有大量生泡，内质网肿胀，核膜连续性破坏，但未发现有凋亡小体的存在。 结论:(l)ERQ阴性MDA一MB一231和MDA一MB一435乳腺癌细胞ERa基因5’端核心启动子区存在CpG岛甲基化，可能是导致ERQ基因表达沉默的主要原因;(2)麟苯哒嗦能作为去甲基化药物诱导因启动子区CpG岛甲基化而表达沉默的ERQ基因表达，同时亦能诱导因甲基化失活的肿瘤抑制基因mas pin再表达，说明阱苯哒啧作为去甲基化药物诱导基因表达不具有基因特异性;(3)阱芳哒嗦能抑制ER。阴性乳腺癌细胞生长、诱导细胞凋亡，并能恢复ER。阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性，协同他莫昔芬更能有效抑制ER。阴性乳腺癌细胞生长，诱导细胞凋亡，从而为ER。阴性乳腺癌开辟新的内分泌治疗途径提供了新的思路。