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正常情况下气管、支气管上皮细胞和粘膜下腺分泌的粘液是机体固有免疫的重要组成部分,它对入侵气道的各种异物、病原体具有屏障、清除作用。但在病理情况下,过度分泌的粘液是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)、支气管扩张、囊性纤维化(Cystic fibrosis, CF)等慢性气道疾病发病、死亡的常见原因,目前仍缺乏有效的治疗手段。阐明气道粘液合成的调控机制,将为气道粘液高分泌提供新的治疗靶点,对开发有效抑制气道粘液高分泌的新药物具有重要意义。粘蛋白MUC5AC是气道粘液的主要成分,所以研究其表达的调控机制尤为重要。多种细菌均可诱导气道粘蛋白MUC5AC表达上调,包括致呼吸道感染的常见细菌--铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)及其胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),但目前PA-LPS上调气道粘蛋白MUC5AC表达的分子机制尚未完全阐明。最近有研究发现活性氧(Reactive oxygen species, ROS)可通过TACE→TGF-α→EGFR信号通路介导香烟烟雾、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase, NE)上调气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC的表达；本实验室既往研究发现可能存在TLR4-PKC-Duox1信号通路调控PA-LPS诱导的气道上皮细胞ROS合成,进而通过ROS及其下游的信号通路TACE-TGF-α-EGFR调控粘蛋白MUC5AC的表达。以上研究提示氧化应激在PA-LPS诱导气道MUC5AC高表达中具有重要作用。核因子相关因子2 (NF-E2-related factor2, Nrf2)是细胞抗氧化应激反应的调节中枢,其活性主要由Keap1 (Keleh-like ECH-associated protein 1)负性调节。生理状态下,Nrf2与Keap1相耦联,后者与胞浆肌动蛋白结合而被锚定在胞浆,通过泛素介导的蛋白降解系统维持Nrf2的基础水平；而在氧化应激作用下,Nrf2与Keap1解耦联、转移入核,与其专性伴侣--小Maf蛋白结合成异二聚体,识别并结合抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)上GCTGAGTCA位点,启动ARE调控的抗氧化酶基因,如：谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST)、NADP(H)醌氧化还原酶INADP(H):quinine oxidoreductase, NQO1】、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位【catalytic subunits of y-glutamylcysteine ligase(GCLc)】及血红素氧化酶1 (heme oxygenase-1, HO-1)等表达,增加细胞对氧化应激的抗性。近年来大量研究显示Keap1/Nrf2信号通路参与了肿瘤、老化、哮喘、急性肺损伤、肺纤维化、动脉粥样硬化、神经退行性变、慢性炎症和自身免疫病等疾病的病理生理过程。既往研究表明化学合成的三萜化物CDDO,通过增强Nrf2活性、抑制NF-K B活化,可以减轻LPS诱导的肺囊性纤维化小鼠模型的气道炎症；在Nrf2敲除的实验性败血症小鼠模型中,LPS刺激30分钟内,小鼠肺部炎症加重、大量与天然免疫反应有关的前炎症因子产生,感染性休克的死亡率明显增高。上述研究虽表明Keap1/Nrf2信号通路能有效抑制LPS诱导的肺部炎症,但对于该信号通路是否参与调控PA-LPS诱导气道MUC5AC表达目前国内外未有报道。本课题拟以气道上皮细胞A549为研究对象,研究Keap1/Nrf2信号通路在PA-LPS上调气道MUC5AC中的作用,以阐明氧化应激调节PA-LPS诱导气道粘蛋白MUC5AC表达的机制。第一部分：铜绿假单胞菌脂多糖诱导人体气道上皮细胞系A549细胞MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1)的表达目的：探讨铜绿假单胞菌脂多糖(PA-LPS)诱导A549细胞粘蛋白MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1)表达。方法：不同浓度(5ug/mL、10 ug/mL和15 ug/mL)PA-LPS干预体外培养的A549细胞不同时间(Oh、8h、12h、24h),用实时荧光PCR(Q-PCR)分别检测干预后MUC5AC mRNA的表达水平,以明确PA-LPS是否能上调A549细胞MUC5AC的表达,以及PA-LPS最佳干预浓度和时间。干预24h后采用Western Blot检测MUC5AC以及抗氧化因子蛋白的表达。结果：lOug/mL PA-LPS干预24h后,A549细胞粘蛋白MUC5AC mRNA及蛋白水平均明显上调(p<0.01); Keap1/Nrf2下游抗氧化基因NQO1、GCLC和GST-pi的表达上调,以NQO1显著(p<0.05)；HO-1表达下调(p<0.05)。结论：①铜绿假单胞菌脂多糖(PA-LPS)可上调A549细胞粘蛋白MUC5AC的表达；②PA-LPS可调控Keap1/Nrf2及其下游抗氧化基因NQO1、GCLC、GST-pi和HO-1的表达；③Keap1/Nrf2信号通路可能参与调控PA-LPS诱导人体气道上皮细胞系A549细胞粘蛋白MUC5AC的表达。第二部分：Keapl/Nrf2信号通路在铜绿假单胞菌脂多糖诱导人体气道上皮细胞系A549细胞MUC5AC表达中的作用目的：探讨Keap1/Nrf2信号通路在PA-LPS上调A549细胞粘蛋白MUC5AC表达中的作用。方法：体外培养人体气道上皮细胞系A549细胞,分别用不同剂量Nrf2 siRNA和Nrf2过表达质粒(pCDNA3-Myc3-Nrf2)转染该细胞,转染24h后,去血清过夜培养,加入10ug/mL LPS干预不同时间,Q-PCR检测该细胞Nrf2及MUC5AC mRNA的表达情况以确定最佳转染剂量和PA-LPS干预时间。同前方法检测PA-LPS干预Nrf2siRNA和Nrf2过表达质粒转染后A549细胞MUC5AC, Keap1/Nrf2及其下游氧化基因mRNA及蛋白的表达情况。结果：Nrf2 siRNA有效抑制A549细胞Nrf2 mRNA的表达,下调其mRNA表达水平约82%;PCDNA3-Myc3-Nrf2明显增强A549细胞Nrf2 mRNA的表达,上调其mRNA表达水平200余倍。与对照组相比,Nrf2 siRNA明显增强PA-LPS对A549细胞MUC5AC mRNA及蛋白表达的上调(p<0.01);pCDNA3-Myc3-Nrf2明显抑制PA-LPS对A549细胞MUC5AC mRNA及蛋白表达的上调(p<0.01)。结论：本研究表明Keap1/Nrf2信号通路参与调控PA-LPS上调粘蛋白MUC5AC的表达。