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角蛋白是难降解纤维状蛋白,由二硫键、氢键、疏水键高度交联组成。这种结构导致角蛋白具有高机械强度,并且不被一般蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)所降解。角蛋白是羽毛的主要组成成分,在成熟羽毛中含量超过10%。羽毛是家禽加工产业的废弃物,全球每年可产生数千万吨羽毛,通过微生物降解处理废弃羽毛意义重要。蜡状芽孢杆菌X5是本实验室从缫丝废水中分离并鉴定的一株羽毛角蛋白降解细菌(GenBank注册号:FJ763651),对羽毛降解效果稳定。以废弃羽毛为底物,采用统计分析方法对X5菌株降解废弃羽毛的发酵培养基及发酵条件进行了优化。主要研究结果如下。1、对实验室保存的10株羽毛降解细菌进行降解能力测试。降解率达到80%以上的菌株为:X5、S64、S68菌株,其降解率分别为91.4%、89%和88.7%;发酵液中氨基酸含量在2000μg/mL以上的菌株有X5、X8、X10、S64、S68菌株。发酵液中蛋白质含量最高的是S59菌株,为194μg/mL。结合降解率、氨基酸及蛋白质含量三个指标稳定性,选择蜡状芽孢杆菌X5进行发酵优化2、通过摇瓶培养,结合统计分析方法研究了发酵培养基组成和发酵条件对X5菌株降解羽毛的影响。通过单次单因子试验和正交试验确定了发酵培养基的成分。运用PB设计试验研究了发酵培养基组分对降解效果的影响。结果表明,KH2PO4和K2HPO4为显著影响因子。采用最陡爬坡路径试验逼近最大响应区域,通过中心组合试验和响应面分析,获得最佳发酵培养基。最佳培养基配方为:CaCO3 1g,KH2PO4 0.68g,K2HPO4 3.2g,羽毛 80g,水1000mL。在优化后发酵培养基的基础上,对发酵条件进行了筛选。采用单次单因子试验研究了接种量、发酵温度、发酵时间、最适pH对羽毛降解率的影响。最佳发酵条件为:种龄20 h,接种量2%(v/v),发酵温度38 ℃,转速220 r/m,发酵时间40 h,初始pH 8。运用最佳发酵培养基和发酵条件进行摇瓶发酵,羽毛降解率由41.3%提高到81.3%,羽毛添加量由2%提高到8%。3、发酵40 h后,将发酵液100 ℃灭菌10 min,离心过滤收集上清液,通过茚三酮反应测定了发酵液上清液中氨基酸的含量,通过考马斯亮蓝法测定了发酵液上清液中蛋白质的含量,结果为发酵液上清液中氨基酸含量为48.4g/L,蛋白质含量为8.12g/L发酵液经离心,过滤收集上清液,经旋转蒸发、冷冻干燥后制成干粉进行氨基酸种类及含量分析,结果表明,发酵液中共含有17种氨基酸,与羽毛氨基酸组成一致,并且含多种动物所需要的必需氨基酸,其中谷氨酸相对含量为10.1%,半胱氨酸相对含量为6.75%,脯氨酸相对含量为16.4%,苯丙氨酸相对含量为8.26%。