酶稳定化机制是生物学家密切关注的科学问题。以酶结构为基础,应用蛋白质工程技术来探索酶稳定性与催化效率/底物选择性复杂作用机制,不仅能揭示酶蛋白的自然进化规律,同时也将为酶生物催化剂的工业应用奠定基础。结构生物学角度研究表明,酶蛋白中每个组成氨基酸原子的电子密度在平衡位点存在着空间“模糊度”,即B-factor。近年来,科学家们对高B-factor残基替换来提高酶稳定性的研究高度关注,但目前仍缺少通用的指导原则,尤其是对分子量较高、结构复杂蛋白质的稳定化已成为挑战。我们课题组从酶最关键部位-活性中心入手,选择高B-factor残基进行突变,促使南极徦丝酵母脂肪酶B(CalB,317个残基)的稳定性明显提高,并揭示了酶活性中心稳定化的结构基础。为更深入和全面地探讨酶活性中心稳定化(Active site stabilization,ACS)机制,本研究选择具有更高结构复杂度的褶皱假丝酵母脂肪酶1(LIP1,534个残基)为研究对象,系统地研究了活性中心高B-factor残基对酶稳定性、催化活性及底物选择性等功能的影响,并通过对相关酶比较分析,探索了这些残基柔性、空间分布等因素对酶稳定性的重要影响。首先,我们对LIP1进行了克隆表达、纯化及性质表征。将装载于穿梭质粒pGAPZαA上的LIP1基因在毕赤酵母中进行了高效表达;纯化的重组酶对中长链的对硝基苯酚酯和甘油三酯底物有较高的水解活力;最适温度为45℃,最适pH为8.0;60℃的半衰期仅为6 min,稳定性较差,进一步突变将有利于改善其酶学性质。为快速构建酶突变库,我们建立了一种基于两步PCR的真核细胞突变库构建新方法,避免了大肠杆菌和限制性内切酶的使用,使建库周期由原来一周时间缩短为一天,转化率达到6.9×10~3/μg。我们对LIP1活性中心附近的残基进行B-factor值分析,选取了催化残基Ser209周围10?以内的18个高柔性残基进行了饱和突变,并从以下两方面探讨其酶学功能的变化机制。1)酶稳定性与底物选择性相关性研究LIP1与其同工酶的序列比对发现,Gly414残基与其它同工酶均不同(Ala/Thr)。该位点位于两个螺旋的转角,属于酶分子中柔性较高的区域;因其在底物通道上,对它的突变可能会对底物的结合产生重要影响。我们对Gly414进行饱和突变,从200多个单菌落中筛选获得了4个稳定性提高的突变体(G414A、G414M、G414H和G414W)。相对于野生型的最适反应温度(45℃),突变体分别提高到50℃、55℃、58℃和60℃。最稳定突变体G414W的最适底物由原来pNP-C8转变为pNP-C4。分子对接和模拟分析显示活性中心中有多个疏水相互作用和氢键形成,这可能是导致其稳定性提高的原因;色氨酸具有β-吲哚基侧链对长链底物的进入形成了较大的空间位阻,从而导致酶的底物偏好性向短链酰基转移。2)酶稳定性与催化活性相关性的系统研究我们进一步又对LIP1活性中心18个高B-factor残基进行了饱和突变,探索酶稳定性与催化活性的相关性。借助平板与两步96孔板结合的三级筛选方法,在保持突变酶活性及稳定性高于野生型酶的双重筛选条件下,从2.0×10~4多个单菌落中获得了5个稳定性和活性都有明显改善的突变体(F344M、F334I、F434Y、F133Y和F121Y)。通过有序叠加组合突变方案,即用稳定性提高幅度最大与次大的逐级叠加,快速获得了稳定性提高最显著的突变体Var3(F344I/F434Y/F133Y/F121Y),60℃的半衰期提升了近40倍,活力与野生型相当。叠加突变过程中,也获得催化效率比野生型高2.2倍的突变体Var1(F344I/F434Y),同时半衰期也提高了近10倍。对突变体模型结构的分析表明氢键网络的形成和紧密的堆叠是提高稳定性的主要原因。为深入认识酶活性中心稳定化现象,我们对具有不同结构复杂度脂肪酶的热稳定突变结果进行了比较分析,探讨了B-factor相对值、突变位点与催化中心的距离对酶稳定性的影响,发现距离催化残基6~10?附近的高B-factor残基(B-factor相对值在60~100)为突变热区,可以提高酶突变的成功率。以上研究表明,酶活性中心稳定化策略能有效提升酶稳定性,对突变体结构-功能关系的系统分析将为深入研究酶区域稳定化规律、发展酶稳定化技术奠定了基础。