背景卵巢癌死亡率居于妇科恶性肿瘤首位,由于其发病隐匿,75%患者确诊时已处于晚期,手术联合化疗是标准治疗,但近30年晚期卵巢癌的生存未见明显提高,晚期患者5年生存率仍不足30%。维持治疗可提高晚期患者生存期和生活质量,标准治疗后采用何种方法进行维持治疗是医学工作者面临的挑战,随着现代分子生物学技术及人类基因组学的发展,精准治疗成为肿瘤治疗的趋势,目前精准靶向治疗药物血管生成抑制剂和PARP抑制剂已用于卵巢癌维持治疗,并显示出一定疗效,但因价格昂贵和伴随副作用等原因限制了其在临床中的使用。探究卵巢癌新的维持治疗方法是临床迫切需要解决的问题。中医维持治疗卵巢癌在临床中应用广泛,疗效确切。益气活血解毒方(YHJD)是在近代名医张锡纯“理冲汤”基础上加减而成维持治疗晚期卵巢癌的有效处方,前期临床试验显示,与安慰剂组相比,YHJD维持治疗能够延长晚期卵巢癌患者中位无进展生存期,改善患者生活质量及中医症状;能下调外周血调节性T细胞,上调细胞毒T细胞。动物实验表明,YHJD可抑制与Tregs相关的免疫抑制因子TGF-β1、IL-10的表达;细胞实验表明YHJD能抑制血管生成,与本方影响Tregs促进肿瘤新生血管相关。综合分析临床和基础的研究,表明YHJD维持治疗可延长晚期卵巢癌患者生存,可能是通过多个靶点共同发挥抗肿瘤作用。YHJD活性成分众多,而卵巢癌又是多基因多通路异常的异质性复杂疾病,故有必要通过全面研究YHJD有效成分与疾病多靶点多通路的相互作用,明确有效机制;并通过对该方作用后疗效差异最显著两组人群的分析,从分子生物学角度,探究该方差异疗效的机制,明确YHJD治疗优势人群的基因特点。网络药理学强调用网络的方法研究多靶点药物作用于人体的整体性动态性,在研究中药复方治疗复杂疾病的核心有效成分、内在机制、干预靶标,及中药的系统性作用机制等方面广泛应用。卵巢癌具有不同的分子亚型和基因组特征,研究患者血液中基因特征,可能发现治疗疗效相关的预测因子。因此,本研究拟使用网络药理学和基因组学研究方法;从网络药理学层面研究YHJD治疗卵巢癌的核心中药、核心活性成分、靶点、通路及作用机制;体内动物实验验证网络药理学分析得到的核心中药对卵巢癌荷瘤小鼠的抑瘤作用;从mRNA芯片联合网络药理学层面,对服用YHJD后无进展生存时间最长和最短的两组患者行mRNA芯片,将得到差异疗效相关的差异基因联合网络药理学,进一步研究YHJD差异疗效的靶点、通路及分子机制,为YHJD临床精准治疗提供一定参考。目的(1)从网络药理学层面探讨YHJD17味中药治疗卵巢癌的核心中药、核心活性成分、靶点、通路及作用机制;(2)构建卵巢癌小鼠模型,通过观察YHJD核心中药治疗荷瘤小鼠移植瘤的抑瘤实验,验证网络药理学结果的可靠性;(3)从临床mRNA芯片联合网络药理学层面,探讨YHJD临床治疗后差异疗效相关的靶点、通路及分子机制,为YHJD临床精准治疗提供一定参考。方法研究分三个部分:一、YHJD治疗卵巢癌作用机制的网络药理学研究;二、YHJD核心中药对ID8荷瘤小鼠移植瘤抑瘤作用的实验研究;三、YHJD治疗卵巢癌差异疗效机制的mRNA芯片联合网络药理学研究。具体如下:一、YHJD治疗卵巢癌作用机制的网络药理学研究1.数据获取:使用TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM和TCMID数据库输入关键词“黄芪”、“女贞子”、“枸杞子”、“白术”、“山药”、“海藻”、“三棱”、“莪术”、“青皮”、“乌药”、“肉桂”、“白花蛇舌草”、“青嵩”、“半枝莲”、“鸡内金”、“水蛭”、“全虫”。以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18 或类药性等级(Druglikeness Grading)≥0.49为活性成分的ADME(机体对外源化学物的吸收、分布、代谢及排泄过程)筛选条件,构建活性成分数据库。以候选基因评分(Candidate Target Genes)>0.8为靶蛋白筛选条件,构建成分对应靶蛋白数据库。使用DisgeNET、GeneCards和DrugBank数据库,输入关键词“ovarian cancer”检索卵巢癌相关基因,构建疾病相关基因数据库。2.网络分析:将成分对应靶蛋白和卵巢癌相关基因进行匹配取交集基因得到重点基因。将重点基因导入string得到蛋白相互作用网络关系,将网络关系导入Cytoscape,使用 Network Interpretation 工具进行网络分析,筛选 Degree>60的节点,为核心基因。使用R语言中的“Bioconductor”、“clusterProfiler”包,进行核心基因的GO功能富集与KEGG通路富集。通过核心基因映射,建立中药、活性成分、核心基因、通路间的对应关系,建立“中药-成分-核心靶点-通路”网络;以Degree≥10为卡值筛选网络中核心中药和核心成分。二、YHJD核心中药对ID8荷瘤小鼠移植瘤抑瘤作用的实验研究1.构建卵巢癌小鼠模型将雌性C57BL/6小鼠右上肢腋下接种1×107个ID8小鼠卵巢癌细胞,共30只,造模成功后随机分为5组:化疗组(顺铂),核心中药组(YHJD核心中药),中西医组(顺铂+YH.JD核心中药),中药组(YHJD),单纯荷瘤组(生理盐水),每组6只;2.观察YHJD核心中药对ID8荷瘤小鼠的抑瘤作用每日观察小鼠一般情况,每周测量一次小鼠日均摄入量、体重、瘤体长短径;当单纯荷瘤组瘤体长径>1cm时结束抑瘤实验,取材后称瘤重,计算各治疗组抑瘤率[抑瘤率=(单纯荷瘤组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/单纯荷瘤组平均瘤重X 100%]。三、YHJD治疗卵巢癌差异疗效机制的mRNA芯片联合网络药理学研究1.数据获取:纳入服用YHJD治疗的Ⅲc-Ⅳ期晚期卵巢癌患者300例,服药半年后抽取外周血,提取RNA并保存。随访后筛选无进展生存最长的8例和最短的7例患者行mRNA芯片检测,筛选P<0.05且差异倍数>1.2的基因为YHJD治疗卵巢癌的疗效相关差异表达基因。2.将疗效相关差异表达基因与研究一中获得的YHJD活性成分对应靶蛋白、卵巢癌疾病相关基因取交集得到差异疗效的核心基因。核心基因导入String构建蛋白相互作用网络,并使用R语言,得到核心基因的Degree排名。核心基因使用R语言进行GO功能富集和KEGG通路富集。通过差异疗效相关核心基因与中药、活性成分、通路的映射,构建差异疗效相关的“中药-成分-核心靶点-通路”网络。结果一、YHJD治疗卵巢癌作用机制的网络药理学研究1.数据获取:YHJD在TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM、TCMID数据库中筛选出符合ADME条件的活性成分193种。YHJD在TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM数据库中筛选出符合条件的活性成分对应靶蛋白877个。DisGeNET、GeneCards、DrugBank数据库中收集卵巢癌相关基因18483个。2.网络分析:YHJD活性成分对应靶蛋白和卵巢癌相关基因取交集得到YHJD治疗卵巢癌的重点靶基因676个。重要靶基因导入String、Cytoscape,以Degree>60为卡值,得到IL6、VEGFA、TNF、MMP9、FN1免疫、血管生成等肿瘤相关核心基因123个。对核心基因GO功能富集显示,YHJD治疗卵巢癌的核心基因参与核受体功能,转录因子活性、聚合酶Ⅱ近RNA端启动子等生物学过程。核心基因KEGG通路富集显示,YHJD治疗卵巢癌的核心基因涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路等免疫、血管生成等肿瘤相关通路。对“中药-成分-核心靶点-通路”网络中的中药进行Degree评价,以Degree≥10为卡值,得到YHJD核心中药枸杞子、半枝莲、青蒿、黄芪、山药,槲皮素、山柰酚、黄芩素、木犀草素等10个活性成分是YHJD治疗卵巢癌的核心活性成分。二、YHJD核心中药对ID8荷瘤小鼠移植瘤抑瘤作用的实验研究1.构建ID8卵巢癌细胞接种量为1×107个/只的C57BL/6小鼠移植瘤模型,接种一周后小鼠全部造模成功,开始给药并观察生长状态。2.荷瘤小鼠给药11周后,单纯荷瘤组各小鼠肿瘤最短长径为1cm,终止抑瘤实验,测量计算抑瘤率[抑瘤率=(单纯荷瘤组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/单纯荷瘤组平均瘤重X 100%],结果显示:(1)核心中药组、中西医结合组、中药组、单纯荷瘤组小鼠摄入量多于化疗组,差异有统计学意义[(2.86±0.49)、(2.46±0.32)克、(2.76±0.38)克、(2.65±0.35)克vs(2.14±0.31)克,均P<0.05]。核心中药组多于中西医结合组,差异有统计学意义[(2.86±0.49)克vs(2.46±0.32)克,P<0.05]。(2)核心中药组、中西医结合组、中药组、单纯荷瘤组小鼠体重高于化疗组,差异有统计学意义[(22.49±0.85)克、(20.45±0.53)克、(21.48±0.86)克、(20.86±0.62)克vs(19.14±1.56)克,均P<0.05]。核心中药组高于中西医结合组、单纯荷瘤组,差异有统计学意义[(22.49±0.85)克vs(20.45±0.53)克、(20.86±0.62)克,均 P<0.05]。(3)各组小鼠肿瘤体积随时间逐渐增大,实验结束时,化疗组、中西医结合组肿瘤体积皆小于单纯荷瘤组,差异有统计学意义[(271 ±67)mm3、(218±128)mm3 vs(510±226)mm3,均 P<0.05]。(4)各组抑瘤率为:核心中药组32.01%,化疗组43.14%,中西医组51.09%,中药组24.45%。三、YHJD治疗卵巢癌差异疗效机制的mRNA芯片联合网络药理学研究1.数据获取:以P<0.05,差异倍数>1.2为卡值,获得YHJD差异疗效相关基因1157个。2.网络分析:1157个差异表达基因与研究一中数据库检索得到的卵巢癌相关基因、YHJD对应的靶蛋白取交集,得到YHJD治疗卵巢癌差异疗效相关核心基因42个。通过R语言工具对Degree进行排序并展示,显示AHR,TIMP1,NFE2L2,CCNB1,PARP1,MCL1,MDM2等基因在核心基因中较重要。核心基因的GO功能富集显示差异疗效相关核心基因GO功能富集在:钠离子跨膜转运蛋白活性、MAP激酶活性、核受体转录辅活化活性、核苷酸酶的活动、MAP激酶活性、激素受体结合、核受体结合等生物学过程。核心基因KEGG通路富集显示卵巢癌差异疗效相关基因主要涉及的通路为:铂耐药、p53信号通路、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响、细胞凋亡等信号通路。构建差异疗效相关的“中药-成分-核心靶点-通路”网络。结论1.YHJD治疗卵巢癌的核心活性成分可能是槲皮素、山柰酚、黄芩素、木犀草素等,核心中药可能是黄苗、山药、枸杞子、半枝莲、青蒿。2.YHJD可能通过调控IL6、VEGFA、TNF等与免疫、血管生成有关的基因抑制卵巢癌;其中AHR等耐药相关基因可能是优势人群被调控的基因。3.YHJD可能通过调节TNF信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等,与免疫、血管生成有关的通路抑制卵巢癌;其中调控铂耐药通路、细胞色素P450等,影响药物代谢及疗效的信号通路可能是治疗优势人群被调控的通路。4.网络药理学分析得到的YHJD核心中药对荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用,并能增强化疗的抗肿瘤作用,改善荷瘤及化疗引起的生活质量下降。网络药理学分析结果具有可靠性。