研究背景热休克蛋白90(Hsp90)是一种高度保守、广泛分布于真核细胞的同型二聚体分子伴侣,其对于维持其客户蛋白的构象成熟与稳定有重要作用,而Hsp90的客户蛋白包括了信号转导分子和细胞周期调控中的关键分子。目前认为,人类的Hsp90包括4种亚型：Hsp90α、Hsp90β、肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRAP)1以及糖相关蛋白(Grp)94。其中Hsp90α易受热诱导,在肿瘤细胞增殖中发挥着重要作用,与生物学行为、肿瘤发生发展及其预后有较密切关系,因此它是本次研究的重点。Hsp90对于细胞周期的正常进程有着十分重要的意义,其中涉及到G2/M期的有周期蛋白依赖性激酶(CDK1)、Myt1、Weel和cyclin B1等。G2/M期阻滞的关键周期蛋白是cyclin B1和CDK1, cyclin B1和CDKl复合体又称有丝分裂促进因子(MPF),该复合体的失活可联合DNA损伤应答反应(DDR)导致细胞周期阻滞。已有研究报道,Hsp90对于cyclin B1在中心体和纺锤体的定位和正确折叠发挥着重要作用。此外,据研究表明,Hsp90抑制剂17-AAG可使细胞阻滞在有丝分裂期并伴随着cyclin B1的蓄积。然而,Hsp90是如何通过影响cyclin B1的表达进而导致细胞周期变化尚不十分清楚。我们课题组前期实验发现在高分化人食管鳞癌组织的角化珠中Hsp90α和cyclin B1呈负相关变化,即在角化珠中Hsp90α呈低表达而cyclin B1呈高表达。有文献报道,由吞噬血红细胞作用导致的氧化应激可在口腔原位癌和鳞状上皮细胞癌上形成未成熟的以及成熟的角化珠。大量研究表明,肿瘤细胞由于自身癌基因的过度激活、高代谢率以及相对缺血缺氧环境会造成持续的氧化应激。另一方面,氧化损伤可导致一些诸如阿尔兹海默和肺纤维化的疾病。由此我们猜测人食管鳞癌中角化珠的形成可能与氧化应激有关。此外,氧化应激诱发的DNA损伤可导致细胞周期阻滞。因此我们进一步猜测高分化人食管鳞癌组织的角化珠中Hsp90α和cyclin B1呈负相关变化可能涉及细胞周期变化,并与氧化应激密切相关,而Hsp90α和cyclin B1在角化珠上的变化机制有待于在细胞生物实验中探讨。对底物降解的精确的时空调控成为泛素和蛋白酶体控制细胞分裂、分化、转录以及信号转导等重要生命活动的基础。细胞周期调控相关蛋白的降解路径主要涉及泛素-蛋白酶体系统。例如,在退出有丝分裂的时候,cyclm B1从MPF中分离需蛋白酶体的协助。此外,泛素-蛋白酶体系统(UPP)可防止细胞受到氧化损伤并维持细胞内稳态。在通常情况下,温和的氧化应激可以促进蛋白酶体降解氧化损伤的蛋白,而高剂量水平的氧化应激可抑制蛋白酶体的活性。氧化应激还可抑制泛素-蛋白酶体中某些特定因子。比如,过氧化氢可阻止泛素(Ub)结合到后期促进复合物(APC/C)的底物中去,这一情况也阻止了cyclin B1的降解,从而促进了由氧化应激引起的细胞生长阻滞。与此同时,Hsp90可激活泛素-蛋白酶体系统并维持26S蛋白酶体的稳定。另一方面,近几年来有不少文献报道氧化应激的产生可导致Hsp90α发生切割从而减弱Hsp90α的功能。又由于cyclin B1的降解涉及泛素-蛋白酶体系统的参与,因此我们猜测在高分化人食管鳞癌的角化珠形成的氧化应激环境下,抑制Hsp90α的功能可能会削弱cyclin B1的降解。本研究的主要目的是证实上述的猜测,探讨在高分化人食管鳞癌的角化珠形成过程中Hsp90是否改变cyclin B1的表达变化并分析导致cyclin B1发生变化的可能机制。此外,研究氧化应激在食管癌细胞系上所致的生物学效应可能对进一步认识其参与食管癌角化珠发生的可能机制以及Hsp90抑制剂在实体肿瘤治疗的作用具有重要意义。目的1.建立氧化应激TE-1细胞模型并确定其DNA双链断裂变化情况；2.确定氧化应激处理对TE-1细胞周期的影响；3.研究氧化应激条件下TE-1细胞内cyclin B1的表达情况以及Hsp90α变化情况；4.研究氧化应激条件下TE-1细胞内蛋白酶体活性变化；5.通过使用Hsp90抑制剂和蛋白酶体抑制剂作为阳性对照组,分别处理TE-1细胞后确定其细胞周期变化和cyclin B1表达情况；6.在上一步的基础上分析Hsp90对其底物分子cyclinB 1的调节作用以及对细胞周期阻滞的影响,并以此进一步探讨在高分化人食管鳞癌的角化珠形成过程中的氧化应激下细胞周期阻滞的分子机制及Hsp90a参与调节的作用机制。方法1.用不同浓度的过氧化氢处理食管癌TE-1细胞,测定其CCK8值,筛选出合适的浓度建立氧化应激细胞模型；2.用流式细胞仪测定不同时间点的氧化应激下的细胞周期分布；3.测定氧化应激状态下食管癌细胞中DNA损伤指标变化；4.测定氧化应激状态下cyclin B1以及其他细胞周期相关调控因子的变化,还有cyclin B1的mRNA变化以及蛋白质合成抑制剂CHX预处理1h后的cyclinB1变化；5.测定氧化应激状态下Hsp90α变化情况；6.测定氧化应激状态下的蛋白酶体的表达量及活性变化以及周期蛋白降解通路相关蛋白水平变化；7.采用Hsp90抑制剂和蛋白酶体抑制剂处理细胞,检测其对cyclin B1表达的影响；8.采用siRNA干扰cyclin B1表达后确定cyclin B1变化对于细胞周期的影响；9.采用抗氧化剂NAC预处理TE-1细胞,确定氧化应激条件下的细胞周期变化是否依赖于活性氧(ROS)变化。10.免疫荧光检测Hsp90α和cyclin B1细胞内共定位情况以及泛素化的cyclin B1变化情况,免疫共沉淀法检测Hsp90与cyclin B1相互作用情况以及泛素化的cyclin B1变化情况。11.通过免疫组化检测人食管鳞癌组织的癌巢或角化珠上Hsp90α和cyclinB1变化关系,还有氧化应激指标HO-1和DNA双链断裂指标磷酸化H2A.X的变化情况。结果1.在H2O2诱导的氧化应激下,TE-1细胞生长受抑制,并且作为DNA双链断裂指标的磷酸化H2A.X以及磷酸化Hsp90α表达量明显增多；2.在H2O2诱导的氧化应激下,TE-1细胞在24h处出现明显的G2/M期阻滞并伴随CDK1失活；3.H2O2诱导的氧化应激可导致cyclin B1的蛋白表达量增加,而cyclin B1 mRNA表达不增加,蛋白质合成抑制剂CHX未使cyclin B1下降到如阴性对照组一致的基线水平。氧化应激处理还可使Hsp90α出现切割条带,提示Hsp90α功能受损,此外氧化应激处理可降低细胞内的蛋白酶体活性；4.作为阳性对照组的蛋白酶体抑制剂MG132和抑制剂17-DMAG分别作用细胞后出现G2/M期阻滞并伴随cyclin B1蓄积,17-DMAG亦导致细胞内的蛋白酶体活性下降；5.通过siRNA下调cyclin B1蛋白表达后,H2O2或17-DMAG处理时仍可导致cyclin B1出现蓄积进而导致G2/M期阻滞,说明cyclin B1蓄积对于G2/M期阻滞至关重要；6.用抗氧化剂NAC预处理后H2O2、17-DMAG和MG132导致的G2/M期阻滞中,ROS可能并未发挥主导作用,细胞内ROS的产生并不能直接导致G2/M期阻滞,而可能是通过Hsp90α功能的抑制：7.免疫荧光与免疫共沉淀结果提示,H2O2诱导的氧化应激可使Hsp90α与cyclin B1相互作用减少,还有泛素化的cyclin B1下降；8.免疫组化结果显示随着高分化人食管鳞癌组织中角化程度的增加,在角化中心区域,Hsp90α表达越来越少,而cyclin B1表达越来越多,两者呈负相关变化。此外,在人食管鳞癌组织的癌巢中,可见HO-1和磷酸化H2A.X高表达,说明此癌巢组织中发生了氧化损伤。结论1.过氧化氢诱导的氧化应激下TE-1细胞的Hsp90α功能受损和26S蛋白酶体活性下降,使cyclin B1出现蓄积,进而导致G2/M期阻滞。2.体外细胞实验结合免疫组化实验结果说明人食管鳞癌组织的角化珠形成可能与氧化应激有关,并且在角化珠形成过程中Hsp90α参与了cyclin B1的表达以及细胞周期调控。