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研究背景及目的:缺血性脑血管病(脑卒中)其高发病率、高致残率和高复发率,已经成为医学防治与康复难题。现有的临床预防、治疗措施主要以早发现、超早期溶栓、抗凝等为主,但其效果往往很不理想。寻找新的防治方法与理论探索成为当务之急的手段,近20年来“卒中单元”兴起,是目前脑卒中最有效的治疗与康复方法。但由于脑卒中的复发率与致残率仍然很高,寻找更为有效的方法预防缺血性脑卒中的发生显得尤为重要。增压氧或高压氧干预由于能增加氧气等物质的弥散半径,直接给缺氧的神经细胞供氧,解除细胞水肿,恢复细胞功能,从而在脑卒中的急性期得到越来越多抢救使用。微压香氧技术改进了高压氧系统,即舱内压力微增压,通过分子筛空气分离制氧技术,建立高于标准大气压20 k Pa-30 k Pa的环境。分子筛技术所产生的制氧浓度可达93%±3%(医用级),将此氧气浓度弥散到舱内,使氧舱内在20 k Pa-30k Pa压力下浓度恒定维持25%,在此浓度下无静电效应,比较安全。“香”即芳香活性小分子物质,通过蒸馏或萃取技术将其高度纯化,使之成为可以通过嗅觉通路直接吸嗅的物质(精油)。微压香氧体系将三者结合在一起,在一个微压空间将氧气疗法与芳香疗法结合形成多效叠加,既保持了高压氧的有效性,又将芳香小分子物质作为一种重要辅助手段应用于其中,形成了脑卒中新的干预手段。MCAO大鼠模型是研究缺血性脑卒中的经典模型,作为模拟人类缺血性脑卒中的一种方法,在研究脑卒中预防、治疗、康复与机制中应用较为理想。因此成功制备MCAO模型是实验顺利进行的关键。本实验室一直从事芳香疗法、氧气疗法与微压疗法相结合研究与医疗实践,近年来创立了“微压香氧”系统。前期对大鼠脑缺血再灌注损伤后用微压香氧干预方面进行研究,本实验从预处理角度对其进行观察研究,一方面探讨其机制,另一方面探索对威胁人类健康的疾病是否存在预防效果。因此,将本实验分为四部分:第一部分MCAO模型的制备;第二部分MCAO大鼠神经行为学评分;第三部分MCAO大鼠脑神经元形态学观察;第四部分用免疫组织化学法、Western blot检测蛋白的表达等。探讨微压香氧预处理是否对缺血性脑卒中有影响及其可能的机制,为预防缺血性脑卒中提供参考价值。第一部分MCAO大鼠的模型制备及神经功能评分方法雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、微压香氧组、微压氧组、模型组,每组15只。微压香氧组和微压氧组造模前14 d(作为预处理组),每天进行干预45 min,于最后一次干预后24 h制备模型。采用线栓法阻断大脑中动脉制备MCAO模型,缺血2 h拔线栓进行再灌注,参考Longa评分法对大鼠进行神经功能评分,将评分为0分、4分大鼠剔除。结果假手术组神经功能评分为0分,无任何行为异常表现。微压香氧组、微压氧组、模型组评分为1-3分不等,大鼠有明显的对侧前爪内收、眼睛Horner征、转圈、倾倒等行为表现。第二部分微压香氧预处理对MCAO大鼠行为学的观察方法分别对实验各组大鼠采取了Longa评分,Berderson评分,平衡木实验等行为学观察与评分;各组行为学评分完成后取部分处死,脑切片行TTC染色,计算脑梗死体积百分比。结果Longa评分结果显示:微压香氧组、微压氧组与模型组比较,差异有显著性(P<0.05);微压香氧组与微压氧组比较,差异有显著性(P<0.05)。对各组动物进行Berderson评分结果显示:同假手术组相比,模型组评分明显增高(P<0.05);同模型组相比,微压香氧组和微压氧组评分降低(P<0.05);同微压氧组相比,微压香氧组评分降低(P<0.05)。平衡木实验评分结果显示:同假手术组相比,模型组评分明显降低(P<0.05);同模型组相比,微压氧组评分无明显差异(P>0.05),微压香氧组评分明显提高(P<0.05);同微压氧组相比,微压香氧组评分提高(P<0.05)。TTC染色结果显示:除假手术组外,其余各组出现了不同程度的梗死灶,与模型组比较,微压香氧组和微压氧组梗死体积明显缩小(P<0.05);同微压氧组相比,微压香氧组梗死体积缩小(P<0.05)。第三部分微压香氧预处理对MCAO大鼠脑PC中神经元形态学的观察方法通过神经行为学实验可以看出微压香氧预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能有保护作用。神经行为学评分完成后各组取部分大鼠处死,经多聚甲醛灌注后取大脑,连续脑组织切片切取PC脑组织,进行HE染色观察神经元形态,尼氏染色观察神经元内尼氏体数量的变化。结果HE染色结果显示:假手术组PC神经元形态正常,胞体较大呈圆形,核仁明显可见,细胞多层排列,整齐、密集;模型组细胞数目减少、排列稀疏,胞体缩小,核固缩呈三角形,部分核消失;微压香氧组和微压氧组较模型组有不同程度的改善,可见少许正常的神经元,排列欠整齐。尼氏染色结果显示:假手术组脑PC神经元胞浆内可见较多深蓝色斑块状尼氏小体,着色深而均匀,细胞形态正常,排列整齐;同假手术组相比,模型组PC神经元胞浆内尼氏小体数量明显减少,有的甚至消失,细胞胞体缩小,排列稀疏;同模型组比较,微压香氧组和微压氧组脑PC神经元胞浆内尼氏小体数目相对增多;同微压氧组比较,微压香氧组尼氏小体数目增多较明显。第四部分微压香氧预处理对MCAO大鼠脑PC内Apaf-1、Caspase-3表达的影响方法为探索微压香氧的作用,免疫组化法检测脑PC内Apaf-1的表达,Western blot法检测脑PC内Apaf-1、Caspase-3含量的变化。结果免疫组化的结果显示:与假手术组相比,模型组的Apaf-1阳性细胞数明显增高(P<0.05);与模型组相比,微压香氧组及微压氧组Apaf-1阳性细胞数均降低(P<0.05);与微压氧组相比,微压香氧组Apaf-1阳性细胞数降低(P<0.05)。Western blot结果显示,模型组Apaf-1平均灰度值较假手术组明显增高(P<0.05);与模型组相比,微压香氧组和微压氧组Apaf-1灰度值均降低(P<0.05);与微压氧组相比,微压香氧组Apaf-1灰度值降低(P<0.05)。模型组Caspase-3平均灰度值较假手术组明显增高(P<0.05);与模型组相比,微压香氧组和微压氧组Caspase-3灰度值均降低(P<0.05);与微压氧组相比,微压香氧组Caspase-3灰度值降低(P<0.05)。结论1.微压香氧预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤能产生神经保护作用。2.微压香氧作用机制与降低脑PC内Apaf-1和Caspase-3蛋白表达有关。3.微压氧和芳香疗法结合产生协同增效作用。