论文部分内容阅读
核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP),是一类具有抗病毒活性的蛋白,通过直接作用于核糖体来抑制蛋白质的合成。RIP根据结构的不同可分为2种类型:I型和II型。Bouganin是从三角梅中分离出来的一种I型核糖体失活蛋白,是目前所发现的毒性最低的一种RIP。根据已报道的Bouganin cDNA序列,设计合成两条引物,在两条引物上分别添加Not I酶切位点,TAA终止密码子和Xho I酶切位点,从厦门本地的光叶三角梅基因组DNA里克隆出了一种新的核糖体失活蛋白基因。将获得的Bouganin基因连接到pMD18-T载体后,进行了测序分析。结果表明长度为750bp,与已报道的Bouganin基因同源性为83%,但推导出的氨基酸序列里,第229氨基酸处出现了一个终止子。pMD-18T-Bouganin用Not I和Xho I酶切后,与经同样酶切的pET28a质粒连接,构建了表达载体pET-28a-Bouganin。含重组子pET-28a-Bouganin的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,菌液及菌体超声破菌后沉淀和上清12% SDS-PAGE电泳,经诱导菌液泳道及超声沉淀泳道均可见一分子量约为29 kDa的蛋白条带,与Bouganin的分子量吻合,而未诱导菌液与超声上清无相应条带,这说明Bouganin以包含体形式正确表达。对诱导条件进行了摸索,在28℃下诱导6小时条件下Bouganin蛋白表达量最高。MTT法进行毒性检测,检测了重组Bouganin蛋白对HepG2癌细胞的毒性作用,表明获得的重组Bouganin蛋白具有一定的细胞毒性。本研究从具有厦门特色的光叶三角梅(Bougainvillea glabra)中的艳紫三角梅品种(Sanderiana)中,利用基因工程方法克隆具有自主知识产权的三角梅失活蛋白的基因,构建其原核表达系统,并获得有活性的蛋白质。Bouganin基因的成功克隆和表达为Bouganin结构和功能的研究奠定了基础,也为农业抗病虫害和医学上抗肿瘤的应用提供了依据。