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目的:脾虚内环境与肝细胞癌的发生进展密切相关,脾虚证是肝癌中医诊断及治疗的重要证型之一。然而,脾虚内环境在影响肝癌发病中的作用机制尚不清楚。因此,本研究首先总结健脾益气治疗在原发性肝癌中的作用及疗效,并进一步阐述脾虚内环境是否通过诱发肝癌干细胞（CSCs）干性表达从而影响肝癌的发生发展,探索脾虚内环境Oatps表达改变及PTEN/AKT通路在肝癌干性表达中的作用及内在机制。方法:第一部分研究基于临床数据探讨中医健脾治疗法在原发性肝癌治疗中的作用、疗效及安全性评价。研究分两步:第一步选取来自中山大学附属第一医院中医科门诊近10年诊断为原发性肝癌或肝癌术后患者一般资料及中医用药资料。使用Python及Excel软件,对上述肝癌患者用药情况及药物使用频次进行统计和聚类分析,明确健脾药物在肝癌治疗中的比重。第二步使用计算机检索中国学术期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库（WANFANG DATA）、维普中文科技刊数据库（VIP）、Cochrane图书馆（Cochrane Library,CL）临床对照试验资料库、荷兰医学文摘数据库（The Excerpta Medica Database,EMBASE）、Pubmed数据库收集自建库起截止至2021年5月有关中医健脾益气疗法协同西医常规疗法联合治疗原发性肝癌的随机对照研究。按照纳入及排除标准,从上述文献中筛选出符合标准的文献14篇,采用Cochrane偏倚风险评估工具进行文献评价,采用由Revman 5.3对筛选出的14篇文献对近期疗效、KPS评分、生存率、免疫功能及不良反应进行系统分析。第二部分研究通过体内外实验证实脾虚内环境对DEN药物诱导小鼠肝癌CSCs干性表达的影响。动物实验采用C57BL/6小鼠随机分为空白组、脾虚组、肝癌组和脾虚肝癌组,以利血平建立脾虚小鼠模型,以二乙基亚硝胺（DEN）及四氯化碳为诱导剂建立肝癌小鼠模型。造模期间观察各组小鼠的饮食量及体质量变化,实验结束后取肝组织进行HE染色进行病理分析。使用RT-PCR及Western Blot技术检测各组小鼠肺肝肾组织中AFP和CD133 m RNA及蛋白的表达情况。取肝癌组及脾虚肝癌组小鼠肝肿瘤提取原代肿瘤细胞,通过悬浮成球实验、迁移实验、克隆实验评估脾虚内环境对肝癌小鼠CSCs干性表达的影响。第三部分研究通过动物实验探索脾虚内环境对DEN诱导肝癌小鼠Oatps表达及PTEN/AKT信号通路的表达改变在肝癌CSCs干性表达中的作用及机制探讨。本研究在第二部分动物实验基础上使用RT-PCR及Western Blot技术检测各组小鼠肺肝肾组织中Oatp2a1、Oatp4a1、Oatp1b2 m RNA及蛋白的表达以观察脾虚内环境下各脏腑对“湿浊”物质的转运情况,同时使用RT-PCR及Western Blot技术检测肺肝肾组织中PTEN、AKT m RNA及蛋白的表达情况以探讨脾虚内环境对肝癌CSCs干性表达的可能机制。结果:第一部分药物分析结果示纳入的1263例肝癌患者的处方,处方使用药物共248味,其中使用频次大于5%的核心药物共44味药,白花蛇舌草作为清热解毒散结药物使用频次最高,约79%的处方都用此药物。其次为太子参,使用频次在69%,炙甘草58%,茯苓58%,均为健脾类药物。核心药物中健脾益气化痰类药物有17个,处方频次合计5916次。结果提示健脾益气,理气和胃药物在肝癌综合治疗患者的核心用药中占比高,使用频次高。Meta分析研究结果示此次系统评价最终纳入14个随机对照试验研究,合计1402例受试者,其中干预组700例（健脾益气治疗+西医常规疗法）,对照组702例（单纯西医常规疗法）。文献质量评价结果显示14篇研究质量均为中度偏倚风险。荟萃分析结果显示:健脾益气疗法联合西医常规疗法治疗原发性肝癌近期疗效优于单纯西医常规疗法组,差异具有统计学意义[OR=2.61,95%CI（2.03,3.37）,P<0.01],生活质量KPS评分高于单纯西医常规疗法组,差异具有统计学意义[OR=9.61,95%CI（4.98,14.24）,P<0.01]。半年生存率两者相当,未见统计学意义[OR=1.24,95%CI（0.62,2.47）,P<0.54]。在免疫功能方面:健脾益气疗法联合西医常规疗法组治疗原发性肝癌患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+数值高于单纯使用常规西医疗法组,CD8+数值低于单纯使用常规西医疗法组,差异均有统计学意义[CD3+:OR=6.63,95%CI（4.67,8.59）,P<0.01;CD4+:OR=7.14,95%CI（5.61,8.68）,P<0.01;CD4+/CD8+:OR=0.5,95%CI（0.39,0.61）,P<0.00001;CD8+:OR=-3.35,95%CI（-5.56,-1.14）,P=0.003]。在安全性方面,健脾益气疗法联合西医常规疗法组治疗原发性肝癌在减少不良反应如白细胞减少、恶心呕吐发生率方面具有疗效优势,均低于单纯常规西医疗法组[白细胞减少:OR=0.51,95%CI（0.32,0.82）,P<0.005;恶心呕吐:OR=0.33,95%CI（0.12,0.92）,P=0.03],但是在血小板下降及肝功能损害发生率方面两者差异并不明显,无统计学差异[血小板下降:OR=0.63,95%CI（0.38,1.05）,P=0.08;肝功能损害:OR=0.31,95%CI（0.08,1.23）,P=0.1]。综上所述,健脾益气疗法联合西医常规疗法可提高肝癌患者的近期疗效,改善KPS评分,增强免疫功能,减少西医治疗副作用。第二部分研究通过动物实验我们发现肝癌小鼠在脾虚造模期间体重下降明显,造模前后体重差异具有统计学意义（脾虚肝癌组P=0.0001<0.05）,待脾虚造模完成后,两组小鼠体重有不同程度恢复,肝癌组（生理盐水注射）体重明显恢复较脾虚肝癌组（利血平注射）明显。DEN药物诱导肝癌造模结束后,肝癌组造模前后体重无明显差异,而脾虚肝癌组造模后体重下降明显,与造模前体重比较有统计学差异（P=0.007<0.05）。对造模期间两组小鼠进食情况比较:与肝癌组比较,脾虚肝癌组小鼠进食量减少,差异有统计学意义（P=0.0014<0.05）。造模结束后肝组织病理结果示脾虚肝癌组肝脏体积明显大于肝癌组,肝癌病理分级恶性度更高。以上研究提示脾虚模型及DEN药物诱导肝癌模型成功,脾虚肝癌小鼠的饮食量减少,体重下降明显,肿瘤体积增大。体外克隆细胞实验发现脾虚肝癌组癌细胞予脾虚小鼠血清刺激后增殖克隆明显增多,细胞增殖面积较肝癌组增多,具有统计学意义（P=0.005<0.05）。细胞划痕实验结果显示划痕第24小时,肝癌组划痕间面积稍减少,而脾虚肝癌组划痕间面积明显缩小,两组比较具有统计学意义（P=0.001<0.05）;划痕48小时,脾虚肝癌组划痕间面积缩小更明显,与肝癌组比较具有统计学意义（P=0.001<0.05）。细胞悬浮成球试验结果显示脾虚肝癌组平均干细胞成球数目较非脾虚肝癌组比较明显升高,其差异具有统计学意义（P=0.001<0.05）。细胞实验证实脾虚内环境可增加肝癌细胞干性自我更新能力的相关生物学特征。AFP表达情况:与空白组比较,肝癌组肝组织中AFP m RNA表达明显升高（P=0.007<0.05）,与脾虚组比较,肝癌组肝组织中AFP m RNA表达明显升高（P=0.036<0.05）;与肝癌组相比,脾虚肝癌组的肝,肺及肾组织中AFP m RNA表达升高（肝P=0.001<0.05,肺P=0.001<0.05,肾P=0.009<0.05）;与空白组比较,脾虚组肺组织中AFP m RNA表达明显升高（P=0.001<0.05）。CD133表达情况:与肝癌组相比,脾虚肝癌组肝及肺组织中CD133 m RNA表达明显升高（肝P=0.025<0.05,肺P=0.03<0.05）,在肾脏组织中则表达降低（P=0.017<0.05）;与空白组比较,脾虚组肝组织中CD133 m RNA表达明显升高（P=0.029<0.05）,而在肾组织中表达降低（P=0.013<0.05）。CD133蛋白在肝组织中表达情况:CD133主要表达在细胞膜及细胞浆中上,四组小鼠肝组织内皆有CD133的阳性表达,其中脾虚肝癌组肝组织中CD133表达较其它三组明显增多。以上结果显提示脾虚内环境下DEN肝癌小鼠肝脏内AFP表达升高,肿瘤干细胞标志物CD133表达也增加,促进了肝癌干细胞自我更新及多向分化,而肺肾两脏参与了脾虚内环境下肝癌的发生发展的过程,肺内CD133表达趋势于肝脏一致,肾脏内CD133表达趋势于肝脏相反。第三部分Oatps表达结果显示:与肝癌组比较,脾虚肝癌组Oatp2a1 m RNA在肺、肝及肾组织中表达明显升高（肺P=0.027<0.05,肝P=0.007<0.05,肾P=0.037<0.05）;与空白组比较,脾虚组肺组织中Oatp2a1 m RNA表达升高（P=0.01<0.05）。与空白组比较,脾虚组肝及肺组织中Oatp4a1 m RNA表达明显升高（肝P=0.049<0.05,肺P=0.0002<0.05）,而在肾组织中表达明显降低（P=0.017<0.05）;与肝癌组比较,脾虚肝癌组肝及肺组织中Oatp4a1 m RNA表达明显升高（肝P=0.043<0.05,肺P=0.002<0.05）。与空白组比较,脾虚组肺、肝及肾组织中Oatp1b2 m RNA表达明显降低（肺P=0.028<0.05,肝P=0.025<0.05,肾P=0.039<0.05）;与肝癌组比较,脾虚肝癌组肾组织中Oatp1b2 m RNA表达明显降低（P=0.012<0.05）。以上结果显示脾虚肝癌小鼠中肝脏高表达的Oatp4a1及Oatp2a1可能与毒药物肝内的蓄积相关,肝内CD133表达升高。肺组织中Oatp4a1及Oatp2a1均表达升高,而CD133表达升高;肾组织Oatp1b2的表达降低,而CD133表达降低,Oatps可能是脾虚内环境紊乱下湿浊物质转运紊乱诱发CD133表达改变的内在机制。PTEN/AKT通路表达情况:与空白组比较,脾虚组肝组织内PTEN m RNA表达明显降低（P=0.047<0.05）;与肝癌组比较,脾虚肝癌组肝组织内PTEN m RNA表达明显降低（P=0.047<0.05）。与空白组比较,脾虚组肺组织内PTEN m RNA表达明显升高（P=0.0002<0.05）;与肝癌组比较,脾虚肝癌组肺组织内PTEN m RNA表达明显升高（P=0.0008<0.05）。而AKT m RNA在脾虚肝癌组中的表达较肝癌组升高,但无明显统计学差异。以上研究结果提示肝内PTEN表达降低,干细胞标志物CD133表达升高可能是脾虚内环境下加速肝癌发生发展的内在机制之一。而肺组织中PTEN表达升高、肾组织中PTEN表达未见改变可能是脾虚内环境湿浊代谢紊乱下肺肾两脏抗肿瘤的自我保护机制之一。结论:健脾益气疗法联合西医常规疗法治疗原发性肝癌可提高近期疗效,改善KPS评分、提高患者免疫功能,减少西医治疗副作用方面优于单纯西医常规疗法组。脾虚内环境下可通过增加肝癌CSCs干性表达影响肝癌的发生发展,其机制可能与脾虚内环境下Oatps介导的“湿浊”物质转运障碍及PTEN表达降低相关。